SD 大鼠乳鼠心房肌細(xì)胞間歇性低氧模型制備

謝竹馨月，王浩南，郭 濤，郭秋哲

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是常見而嚴(yán)重的房性心律失常，AF 導(dǎo)致卒中、心力衰竭、認(rèn)知障礙等將威脅患者生命和降低患者生存質(zhì)量， 已成為嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。既往認(rèn)為AF 主要發(fā)生于器質(zhì)性心臟病患者，伴隨AF 研究的深入和人類疾病譜變化，其他系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺疾病、 阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）、 慢性腎病、 肥胖人群亦可發(fā)生AF[2，3]。 OSA 特指上氣道完全或部分阻塞導(dǎo)致睡眠狀態(tài)下反復(fù)發(fā)作呼吸暫停和/或低通氣，伴夜間打鼾、白天嗜睡等臨床癥狀的一種綜合征。 研究顯示，21%～74%的AF 患者合并OSA，非瓣膜性AF 患者OSA 患病率甚至高達(dá)90%[4]；AF 發(fā)生率與OSA 的嚴(yán)重程度正相關(guān)，夜間血氧飽和度降低的程度是OSA 患者發(fā)生AF 的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[5，6]，OSA 已成為非瓣膜性AF 的主要病因之一。

目前認(rèn)為，睡眠期間反復(fù)發(fā)生上氣道塌陷引起的慢性間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）、微覺醒和胸腔負(fù)壓變化等病理生理因素相互協(xié)同， 共同導(dǎo)致AF 易感。 然而現(xiàn)行的持續(xù)正壓通氣治療OSA 并不能完全降低AF 發(fā)生率[7，8]，原因可能是缺乏對(duì)OSA 致AF機(jī)制的清晰認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)主要通過調(diào)節(jié)環(huán)境O2濃度對(duì)動(dòng)物實(shí)施周期性低氧/復(fù)氧刺激，構(gòu)建模擬OSA 的慢性IH動(dòng)物模型[9，10]。但在體實(shí)驗(yàn)受神經(jīng)-體液諸多因素干擾，難以準(zhǔn)確反映單一因素的生物學(xué)效應(yīng)。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞既能保持其原有結(jié)構(gòu)及功能，又能排除神經(jīng)-體液干擾，可有效反映心肌細(xì)胞電生理特性、信號(hào)傳導(dǎo)通路及基因表達(dá)[11]，在補(bǔ)充和完善在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果、豐富研究?jī)?nèi)容、提高研究準(zhǔn)確度方面有重要作用。 目前已有使用肺腺癌細(xì)胞等細(xì)胞株模擬OSA 構(gòu)建IH 細(xì)胞模型的報(bào)道[12]，但利用原代心房肌細(xì)胞模擬OSA構(gòu)建IH 模型尚無報(bào)道。 成功構(gòu)建心房肌細(xì)胞IH 模型對(duì)闡明OSA 致AF 的分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。

筆者分離、純化、鑒定和培養(yǎng)SD 大鼠乳鼠原代心房肌細(xì)胞，利用IH 干預(yù)模擬OSA 構(gòu)建心房肌細(xì)胞體外IH模型。檢測(cè)不同刺激條件下心房肌細(xì)胞活力變化、缺氧誘導(dǎo)因子-1α （hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3）和縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達(dá)的變化，評(píng)價(jià)建模效果，探索IH 致AF 的分子機(jī)制，為研究OSA 與AF 的關(guān)系提供體外實(shí)驗(yàn)方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF 級(jí)1 ～3 d 齡SD 大鼠乳鼠30 只，雌雄不限。 由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（滇）K2020-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

達(dá)氏修正伊氏培養(yǎng)液 （Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（批號(hào)2033115）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（批號(hào)0033519）、新生牛血清（批號(hào)1927731）、青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)1950172）（BioInd，以色列）；馬血清（批號(hào)1832764。Giboco/Invitrogen，美國(guó)）；山羊血清（批號(hào)904W051）、Brdu 5-溴-2'-脫氧尿苷（批號(hào)4086231）、 膠原酶Ⅱ（批號(hào)701J021）、曲拉通X-100（批號(hào)829I0212）（索萊寶，中國(guó)）；胰蛋白酶1 ∶250（批號(hào)A0801A。 美倫生物， 中國(guó)）；MTS CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent 試劑盒（批號(hào)406301。 Promega，美國(guó)）；Anti ɑ-tubulin 抗體（批號(hào)66031-1-Ig）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-Goat Anti-Mouse IgG（批號(hào)20000191）（Proteintech，美國(guó)）；Anti-HIF-1 alpha 抗體（批號(hào)GR3228170-12）、Anti-caspase-3 抗體（批號(hào)GR219726-22）、Anti-Connexin 43 antibody （批號(hào)GR3287932-4）、 山羊抗兔IgG H&L （HRP）（批號(hào)GR3307521-1）、 山羊抗小鼠IgG （Alexa Fluor@488）（批號(hào)GR3256397-1）、α 橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白 （antisarcomeric alpha actinin） 抗體 （α-SCA 抗體）（批號(hào)GR3296454-1）、 封固劑4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6 -diamidino -2 - phenylindol，DAPI） （ 批 號(hào)GR3353352-3）（Abcam， 美國(guó)）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（批號(hào)69100900。 Biosharp，中國(guó)）。

正常細(xì)胞培養(yǎng)箱、三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heal force，中國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本）；Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)通用電氣公司）。

1.2 方法

1.2.1 心房肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

用75%乙醇溶液清洗乳鼠表面皮膚， 剪開胸骨取出心臟，并置于預(yù)冷的含1%雙抗的PBS 中；更換另外一套無菌器械，修剪去除心室組織，保留薄壁松軟的心房組織，反復(fù)漂洗去除血液；將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的碎塊， 再轉(zhuǎn)移至離心管中。 加入0.05%膠原酶Ⅱ和0.05%胰蛋白酶混合液，于37 ℃水浴消化5 ～10 min（邊消化邊晃動(dòng)離心管），使用等體積含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液終止消化，自然沉淀后收集上清液，重復(fù)以上操作7 ～10 次（棄去第一次消化獲得的上清液，最后一次消化后經(jīng)100 μm 無菌細(xì)胞篩過濾后移入離心管）。在1 000 r/min 室溫離心5 min 后棄上清液， 使用含10 %馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)80 min 后，可將成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等大部分貼壁較快的細(xì)胞去除。 隨后平穩(wěn)取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸出細(xì)胞懸液。 按5×105/mL 將細(xì)胞接種于6 孔板中，并加入Brdu 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，最后放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5 % CO2常氧培養(yǎng)箱中。 培養(yǎng)24 h 后換不含Brdu 的培養(yǎng)液， 于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、貼壁情況、搏動(dòng)情況等并拍照記錄。

1.2.2 心房肌細(xì)胞鑒定

當(dāng)心房肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3 次。 加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，再用PBS 浸洗3 次， 每次5 min。 加入0.1% 曲拉通X-100 室溫通透20 min，PBS 浸洗3 次后加入10%山羊血清，每孔室溫封閉1 h。吸去封閉液，將α-SCA 抗體用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）按1 ∶200 稀釋，于4 ℃條件下過夜孵育。次日，使用PBS 浸洗3 次（每次5min）后，加入山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor@488）并用1%BSA 稀釋使其質(zhì)量濃度為2 μg/mL，室溫下避光孵育1 h 后，用PBS 清洗3 次（每次5 min），滴加3 ～4 滴封固劑DAPI， 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色和封片，室溫下孵育5 min。吸走DAPI，用PBS 清洗。在熒光顯微鏡下觀察并攝片。于200 倍放大顯微鏡下任選10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)陰性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，陽性細(xì)胞率（%）=（細(xì)胞總數(shù)-陰性細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 構(gòu)建心房肌細(xì)胞間歇性低氧模型

將培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞隨機(jī)分常氧組、IH 6 h 組（6 h IH 組）、IH 12 h 組（12 h IH 組）、IH 24 h 組（24 h IH 組）和IH 48 h 組（48 h IH 組）5 組。 常氧組培養(yǎng)24 h 后，使用不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處理4 h。隨后將培養(yǎng)液更換為含10%馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液。 將常氧組放入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱，將6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組和48 h IH組放入三氣培養(yǎng)箱，以體積分?jǐn)?shù)5%O230 min+21%O230 min 為1 個(gè)循環(huán)，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h。

1.2.4 四唑氮化合物法檢測(cè)心房肌細(xì)胞活力

用IH 干預(yù)完成后，將不同組心房肌細(xì)胞消化后接種于96 孔板中（按104/孔加入細(xì)胞懸液，每孔100μL），設(shè)置只含培養(yǎng)液無細(xì)胞的空白對(duì)照。 每100 μL 培養(yǎng)液加四唑氮化合物[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2Htetrazolium，inner salt，MTS]試劑20 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境孵育2 h。 選擇490 nm 波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（optical density，OD）值，每個(gè)樣品設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)各組caspase-3、HIF-1α 和Cx43 表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定各組細(xì)胞的總蛋白濃度，分別配制壓縮膠和分離膠，上樣后蛋白電泳（80 V 恒壓30 min，120 V 恒壓1 h）、濕法轉(zhuǎn)膜（290 mA 恒流轉(zhuǎn)膜120 min）。轉(zhuǎn)膜完成后洗膜3 次（每次5 min），然后用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，洗膜3 次后加入一抗（HIF-1α稀釋倍數(shù)為1 ∶2 000，caspase-3 稀釋為1 ∶5 000，Cx43稀釋為1 ∶2 000，內(nèi)參ɑ-Tubulin 稀釋為1 ∶5 000），4 ℃條件下過夜孵育。 次日，將膜取出，洗膜3 次（每次5 min）；隨后加入對(duì)應(yīng)的二抗（稀釋為1 ∶5 000）室溫孵育90 min，洗膜3 次，每次10 min。 滴加顯影液后置于Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)拍照，以ɑ-Tubulin 作為內(nèi)參， 各目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度比值作為其相對(duì)表達(dá)量，分析各組蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 數(shù)據(jù)均采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， 多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD 法兩兩比較。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD 大鼠乳鼠心房肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

體外培養(yǎng)24 h 后，心房肌細(xì)胞全部貼壁，呈長(zhǎng)梭形或三角形，核仁清晰可見，個(gè)別細(xì)胞可見自律性搏動(dòng)（圖1 左）；培養(yǎng)48 h 后，細(xì)胞伸展，折光性好，可見菊型細(xì)胞團(tuán)形成，有規(guī)律性搏動(dòng)（圖1 中）；培養(yǎng)72 h后，心房肌細(xì)胞體積變大，相互交聯(lián)，形成片狀，搏動(dòng)節(jié)律一致（圖1 右）。 采用α-SCA 抗體免疫熒光法鑒定心房肌細(xì)胞，α-SCA 陽性表達(dá)為綠色熒光，藍(lán)色為DAPI 復(fù)染的細(xì)胞核（圖2）。 隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)視野，心房肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h 時(shí)，α-SCA 陽性細(xì)胞率達(dá)85%～90%。

圖1 光學(xué)顯微鏡下心房肌細(xì)胞原代培養(yǎng)24 ～72 h（200×）Fig.1 Images of cultured neonatal rat atrial myocytes at 24-72 hours(200×)

圖2 免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞（左200×，右400×）Fig.2 Images of cardiomyocytes identification by immunofluorescence staining(left 200 ×,right 400×)

2.2 間歇性低氧對(duì)心房肌細(xì)胞活力的影響

不同組心房肌細(xì)胞經(jīng)IH 干預(yù)后，在光學(xué)顯微鏡下均可見部分死亡細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。 MTS 法檢測(cè)心房肌細(xì)胞活力，常氧組、6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組、48 h IH 組OD 值 分 別 為1.66 ± 0.12、1.38 ±0.14、1.69±0.08、1.70±0.18、2.19±0.17（F=16.391，P<0.001）。 6 h IH 組OD 值較常氧組明顯下降，但隨IH 干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，OD 值逐漸上升；48 h IH 組OD 值甚至高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 5 組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 間歇性低氧對(duì)心房肌細(xì)胞各類蛋白的影響

常氧下HIF-1α 不能穩(wěn)定表達(dá)，但心房肌細(xì)胞經(jīng)IH 6 h、12 h、24 h 和48 h 干預(yù)后， 隨IH 時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α 蛋白表達(dá)水平逐漸增高，48 h IH 組增高最明顯（P<0.05）。6 h IH 組cleaved caspase-3 的表達(dá)量較常氧組略升高， 隨后開始下降并保持較穩(wěn)定的水平；12 h IH、24 h IH、48 h IH 組的表達(dá)量較6 h IH 組明顯下降（P<0.05）；與常氧組比較，12 h IH 組和24 h IH組cleaved caspase-3 表達(dá)量降低（P<0.05）。 Cx43 蛋白表達(dá)隨IH 干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)；6 h IH 組、12 h IH 組、24 h IH 組、48 h IH 組Cx43表達(dá)均較常氧組明顯降低（P<0.05），但各IH 干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見表1、圖2。

表1 不同組別HIF-1α、cleaved caspase-3、Cx43 蛋白水平比較Tab.1 Comparison of HIF-1α, cleaved caspase-3 and Cx43 protein levels in each group

3 討論

OSA 是高血壓、冠心病、心力衰竭、AF 等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其主要病理生理機(jī)制是IH。目前主要通過低氧艙、手術(shù)或干預(yù)動(dòng)物呼吸規(guī)律來構(gòu)建OSA 致AF 的動(dòng)物模型，這些動(dòng)物模型均觀察到心房電-解剖重構(gòu)和AF 易感性增加[13，14]。 然而在體研究受神經(jīng)-體液諸多因素干擾，難表征單一刺激因素對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因表達(dá)的影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有選擇性高、周期短、依從性高、易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)在體實(shí)驗(yàn)的不足。 H9c2 心室肌細(xì)胞表現(xiàn)出與原代心肌細(xì)胞相似的氧化損傷特性， 被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建缺血/再灌注模型。 Li G 等[15]利用三氣培養(yǎng)箱以體積分?jǐn)?shù)5%O230 min+ 體積分?jǐn)?shù)21%O230 min 為1 個(gè)循環(huán)，成功構(gòu)建IH 致H9c2 心室肌細(xì)胞肥厚的模型。但H9c2 細(xì)胞缺乏自律性和收縮性，不具備心肌細(xì)胞特有的電生理特性，不能客觀、真實(shí)觀察到心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)、收縮功能和相關(guān)信號(hào)通路的變化。 筆者復(fù)習(xí)文獻(xiàn)， 利用SD 大鼠乳鼠心房肌細(xì)胞構(gòu)建IH 模型并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件， 模擬OSA 狀態(tài)下心房肌細(xì)胞反復(fù)低氧/復(fù)氧、不缺血的狀態(tài)，探討不同IH 刺激時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞活力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探尋OSA 致AF 的可能機(jī)制。 結(jié)果顯示，IH 引發(fā)的HIF-1ɑ 蛋白表達(dá)上調(diào)呈時(shí)間依賴性；OD 值隨IH 刺激時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高；cleaved caspase-3 表達(dá)呈先升后降并逐漸趨于穩(wěn)定；Cx43 表達(dá)因IH 刺激而下調(diào)但無時(shí)間依賴性。

圖3 不同組HIF-1α、cleaved caspase-3、Cx43 蛋白表達(dá)水平電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of HIF-1α, cleaved caspase-3 and Cx43 protein expression levels in different groups

HIF-1 是低氧誘導(dǎo)因子家族的成員，由組成性表達(dá)HIF-1β 亞基和氧濃度調(diào)節(jié)亞基HIF-1ɑ 組成。HIF-1ɑ 在常氧條件下不能穩(wěn)定表達(dá)。 細(xì)胞缺氧時(shí)，HIF-1ɑ 降解減少并與HIF-1β 形成異源性二聚體，在轉(zhuǎn)錄激活因子作用下與靶基因結(jié)合，有利于細(xì)胞在低氧環(huán)境中存活[16]。 研究顯示，HIF-1α 在IH 刺激下持續(xù)高表達(dá)[17，18]，可用作IH 干預(yù)成功的標(biāo)志。 筆者研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 蛋白表達(dá)量隨IH 干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，說明該IH 模型可有效模擬OSA 過程。

caspase-3 是細(xì)胞內(nèi)最重要的凋亡蛋白之一，cleaved caspase-3 是caspase-3 被剪切后激活形成、具有催化功能并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[19]，其表達(dá)量直接反映細(xì)胞凋亡的程度。缺氧可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、 介導(dǎo)心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)、 誘導(dǎo)AF 發(fā)生和維持[20，21]。MTS 是一種新型四唑化合物， 可被代謝活躍細(xì)胞內(nèi)脫氫酶產(chǎn)生的還原型輔酶II 或還原型輔酶I 還原為有色的甲臜產(chǎn)物，直接溶解于培養(yǎng)液。 490 nm 處OD值代表甲臜產(chǎn)量，OD 值越高則細(xì)胞活力越強(qiáng)。 藥物處理、培養(yǎng)條件改變、理化刺激可影響細(xì)胞活力。一般而言，反復(fù)IH 導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝異常、細(xì)胞活力變化、加速細(xì)胞過氧化損傷甚至細(xì)胞凋亡[22~24]。 而筆者研究實(shí)施的IH 刺激未導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞死亡和活力下降，間接證明此建模方法安全、可行。IH 刺激時(shí)長(zhǎng)、循環(huán)次數(shù)、缺氧程度對(duì)細(xì)胞有不同效應(yīng)。 楊勝昌等[25]發(fā)現(xiàn)，高頻IH（體積分?jǐn)?shù)1%O27 min+體積分?jǐn)?shù)21%O23 min 為1 個(gè)循環(huán)） 刺激下細(xì)胞活力低于中頻組（體積分?jǐn)?shù)1%O220 min+ 體積分?jǐn)?shù)21%O210 min為1 個(gè)循環(huán)）；Chang JC 等[26]觀察到，體積分?jǐn)?shù)5%O230 min + 體積分?jǐn)?shù)21 % O230 min 為1 個(gè)循環(huán)持續(xù)96 h 的IH 刺激可降低心室肌細(xì)胞過氧化損傷，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)胞存活。 筆者推測(cè)，IH 引發(fā)的細(xì)胞活力和cleaved caspase-3 表達(dá)水平變化未完全呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，與IH 刺激調(diào)控了某些基因的表達(dá)、改善了心房肌細(xì)胞對(duì)IH 刺激的適應(yīng)性可能有關(guān)。

Cx43 是心肌細(xì)胞間縫隙連接的重要蛋白分子，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度和方式及心臟同步收縮中起重要作用。Cx43 表達(dá)量、分布和磷酸化異常可影響心肌細(xì)胞間興奮傳導(dǎo)的速度和方向，引發(fā)折返激動(dòng)[27]。Cx43 表達(dá)異常普遍存在于AF 的病理生理過程， 不同病因AF 患者的心房組織中均可觀察到Cx43 表達(dá)異常。 研究顯示，OSA 合并AF 患者的血清Cx43 基因表達(dá)水平較無AF 患者明顯下降[28]；OSA 致AF 的動(dòng)物模型也觀察到心房組織中Cx43 表達(dá)下降、分布異常、傳導(dǎo)速度減慢和AF 易感性增加[14，29]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)難于確保Cx43 的改變只與IH 有關(guān)而非神經(jīng)-體液因素干擾所致。 筆者研究則證實(shí)IH 刺激可直接降低心房肌細(xì)胞Cx43 表達(dá)的水平， 提示Cx43 重構(gòu)先于AF 發(fā)生，可能在AF 發(fā)生和維持中扮演重要角色。

4 結(jié)論

以體積分?jǐn)?shù)5 % O230 min + 體積分?jǐn)?shù)21 % O230 min 為1 個(gè)循環(huán)對(duì)SD 大鼠乳鼠離體心房肌細(xì)胞施加IH 刺激，HIF-1ɑ 表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加， 較長(zhǎng)時(shí)間IH 刺激下，SD 大鼠乳鼠心房肌細(xì)胞仍可存活，該方法成功構(gòu)建的IH 心房肌細(xì)胞模型的制備。IH 刺激下調(diào)心房肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)可能是IH 誘發(fā)AF的分子機(jī)制之一，而IH 刺激是否可以改變心房肌細(xì)胞膜電位水平從而誘發(fā)AF，仍待進(jìn)一步探索。筆者研究為探究OSA 導(dǎo)致AF 的機(jī)制提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。