miR-221與E-cadherin在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

詹江輝，楊雪，狄文玉，魯廣建

(1.新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.輸血科;b.病理科;c.檢驗(yàn)科，河南 新鄉(xiāng) 453100)

腎細(xì)胞癌中最常見的病理類型是腎透明細(xì)胞癌，目前腎透明細(xì)胞癌主要通過手術(shù)切除來(lái)達(dá)到治療的目的，但是大約30%的患者在隨訪中發(fā)現(xiàn)手術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此腎透明細(xì)胞癌較其他類型腎癌預(yù)后差[1]。有研究顯示miR-221在不同的惡性腫瘤組織中表達(dá)升高。有研究者篩選出由miR-181b-5p、miR-183-5p、miR-199-5p和miR-221-3p組成的多種miRNA組合在預(yù)測(cè)膀胱癌發(fā)生方面更好、更可靠，可以代表膀胱癌診斷的穩(wěn)定生物標(biāo)志物[2]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-221/222的異常表達(dá)可以改變前列腺細(xì)胞對(duì)雄激素的反應(yīng)，從而潛在參與向去勢(shì)抵抗前列腺癌轉(zhuǎn)變，上調(diào)miR-221/222的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中上皮細(xì)胞失去上皮特征和完整性，獲得間充質(zhì)特征，運(yùn)動(dòng)能力增加。E-cadherin是黏附連接的關(guān)鍵成分，E-cadherin表達(dá)缺失導(dǎo)致接觸抑制缺失，并與細(xì)胞活力增加和癌癥晚期相關(guān)[4]。因此，本研究通過檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌中miR-221的表達(dá)及EMT相關(guān)分子E-cadherin的表達(dá)，并分析其相關(guān)性，探討miR-221在腎透明細(xì)胞癌高表達(dá)的臨床意義，為腎細(xì)胞癌的生存及預(yù)后提供潛在的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2015年1月至2016年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受根治性腎切除術(shù)符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的38例腎透明細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象，并收集癌組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，癌旁正常組織標(biāo)本為對(duì)照組?；颊叽_診腎透明細(xì)胞癌后進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為5 a，若在此期間患者死亡則停止隨訪。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受手術(shù)治療且術(shù)后經(jīng)過病理診斷為原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌；(2)手術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療等抗癌治療；(3)臨床資料完整容易收集；(4)出院后隨訪資料容易獲得且未失訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)中未能完整切除腫瘤組織；(2)合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)合并腎炎；(4)先天性腎畸形或發(fā)育不良。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Sybr green Ⅰ mix購(gòu)自日本Takara公司，ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司，鼠抗人E-cadherin抗體及免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BX53顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取 取出液氮中保存的癌組織及癌旁組織，放于研缽中，其間不斷加入液氮待研磨成粉末之后將其裝入EP管中。加入TRIzol裂解試劑 1 mL，用吸管反復(fù)吹吸以充分裂解。加入氯仿200 μL，劇烈震蕩1 min充分萃取。4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，上清液中即為提取的RNA。吸取上清液至另一新的EP管中，加入等量的異丙醇。4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇后混合均勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。棄去上清液，放置冰上讓乙醇充分揮發(fā)。加入適量的DEPC水，使RNA溶解。使用分光光度計(jì)測(cè)定提取出來(lái)的RNA的濃度，OD260/OD280在1.7～2.1時(shí)，說明RNA純度較高。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織中miR-221的表達(dá) 根據(jù)M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照Sybr green Ⅰ mix試劑盒說明在20 μL反應(yīng)體積中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 S，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。每組做3個(gè)復(fù)孔。使用U6作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-221的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色 將收集好的癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本放入組織固定液里面固定4 h。將組織塊放入梯度酒精中脫水。放入二甲苯溶液中透明處理，然后浸蠟，包埋，切片，脫蠟，水化。放于枸櫞酸鈉溶液中，然后將其放入微波爐中修復(fù)抗原表位。切片上滴加H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。在切片上滴加山羊血清封閉液封閉非特異性位點(diǎn)。組織切片上滴加鼠抗人E-cadherin一抗，放置于4 ℃的冰箱里過夜。組織切片上滴加試劑盒中的二抗。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。組織切片上滴加DAB顯色液。滴加蘇木精染色液進(jìn)行復(fù)染5 min。再進(jìn)行脫水，透明，封固。在高倍顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色判斷標(biāo)準(zhǔn)每張切片在200倍顯微鏡視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，由兩位高年資的病理醫(yī)生分別進(jìn)行獨(dú)立閱片。根據(jù)200倍顯微視野下的染色程度和陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評(píng)分，其中陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分規(guī)則為：≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，76%～100%記為4分。染色程度評(píng)分規(guī)則為：未著色記為0分，著淺黃色記為1分，著棕黃色記為2分，著棕褐色記為3分。計(jì)算染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積。乘積結(jié)果為0～4分判斷為低表達(dá)，低表達(dá)結(jié)果判斷為陰性；6～12分判斷為高表達(dá)，高表達(dá)結(jié)果判斷為陽(yáng)性[5]。

2 結(jié)果

2.1 miR-221在腎透明細(xì)胞癌組織與癌旁組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系miR-221在實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量為4.911±1.064，在對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)量為1.163±0.238，在實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見圖1)。在癌組織標(biāo)本中，miR-221的相對(duì)表達(dá)量在Fuhrman不同分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同年齡、性別、腫瘤大小、腎靜脈內(nèi)有無(wú)癌栓方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌患者實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中miR-221表達(dá)

表1 miR-221表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 腎透明細(xì)胞癌患者E-cadherin的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜上(見圖2、3)。在實(shí)驗(yàn)組中E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率為26.32%(10/38)，對(duì)照組中E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率81.58%(31/38)，兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.356，P<0.001)。E-cadherin的表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓形成方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在Fuhrman不同分級(jí)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

A為腎透明細(xì)胞癌組織；B為癌旁組織。圖2 腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織HE染色(200×)

表2 E-cadherin與腎透明細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3 腎透明細(xì)胞癌患者miR-221的表達(dá)與E-cadherin的相關(guān)性對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中miR-221與E-cadherin的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r為-0.569(P<0.001)，表明miR-221與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(見圖4)。

圖4 腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中miR-221的表達(dá)與E-cadherin表達(dá)的Spearman相關(guān)性分析

2.4 腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中miR-221表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系在腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中miR-221表達(dá)平均數(shù)為4.911，以4.911為界限，將腎透明細(xì)胞癌患者分為miR-221高表達(dá)組(>4.911)17例和miR-221低表達(dá)組(<4.911)21例，其中失訪病例已排除出組。38例腎透明細(xì)胞癌患者經(jīng)過5 a隨訪，總生存26例，死亡12例。Kaplan-Meier法生存曲線結(jié)果顯示miR-221高表達(dá)組5 a生存率為52.94%(9/17)，miR-221低表達(dá)組5 a生存率為80.95%(17/21)，miR-221高表達(dá)組與miR-221低表達(dá)組生存曲線比較log-rank檢驗(yàn)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.329，P=0.037)(見圖5)。

圖5 腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中miR-221高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線

3 討論

腎細(xì)胞癌是比較常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中腎透明細(xì)胞癌是最常見的腎細(xì)胞癌類型，占腎惡性腫瘤的90%，其他亞型包括乳頭狀腎細(xì)胞癌占6%～15% ，嫌色腎細(xì)胞癌占2%～5%[6]。早期發(fā)現(xiàn)對(duì)患者預(yù)后非常重要，被診斷為器官局限性疾病的患者5 a生存率約為90%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍然很差，5 a生存率不到10%[7-8]。腫瘤復(fù)發(fā)主要是由于腎細(xì)胞癌對(duì)化療和放療的抵抗，5%～10%的腎透明細(xì)胞癌病例延伸到腎靜脈或下腔靜脈[9]。舒尼替尼通常用作腎細(xì)胞癌的一線治療，盡管舒尼替尼對(duì)10%～20%的晚期腎細(xì)胞癌患者本身治療無(wú)效[10]。因此，迫切需要增加對(duì)腎細(xì)胞癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的了解，同時(shí)發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)志物用于腎癌的預(yù)后評(píng)估。

miRNA是一類高度保守、半衰期長(zhǎng)的非編碼小分子RNA。成熟的miRNA以20～24個(gè)核苷酸的miRNA雙鏈體形式存在，包括miRNA引導(dǎo)鏈及其互補(bǔ)的過客鏈[11]。研究顯示miR-221在不同的癌癥類型中表達(dá)升高，其具有類似癌基因的功能。在膀胱癌中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-221的下調(diào)通過增加TP53INP1誘導(dǎo)自噬，并通過抑制ERK的激活來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且miR-221與膀胱癌患者的不良生存率相關(guān)[12]。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-221的表達(dá)顯著高于鄰近正常組織，且miR-221表達(dá)與肝癌患者的腫瘤TNM分期有相關(guān)性，miR-221表達(dá)降低可以延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間[13]。在胃癌中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中miR-221表達(dá)明顯升高，miR-221表達(dá)較高的患者預(yù)后明顯較差，miR-221可以調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡[14]。有研究者使用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)的生存分析表明，miR-221的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的低生存率相關(guān)，表明miR-221可能通過抑制自噬和靶向TP53INP1促進(jìn)結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖[15]。有研究顯示miR-221的靶基因包括p27 Kip1、p57 Kip1、PTEN、c-kit等，除此之外，miR-221在平滑肌細(xì)胞增生和人類老齡化進(jìn)程中也起著重要的作用[16]。本研究檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌中miR-221的表達(dá)，研究結(jié)果顯示在癌組織中miR-221表達(dá)量高于對(duì)照癌旁組織，臨床病理參數(shù)分析結(jié)果表明miR-221的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、靜脈內(nèi)癌栓無(wú)關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Fuhrman分級(jí)有關(guān)。

EMT是一種最初在發(fā)育早期觀察到的過程，在這個(gè)過程中可將極性固定的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，運(yùn)動(dòng)能力增加。在EMT的過程中，具有上皮特征的E-cadherin表達(dá)降低，具有間充質(zhì)特征的N-cadherin、波形蛋白等表達(dá)量增加[17]。E-cadherin表達(dá)的喪失與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，多項(xiàng)研究表明，E-cadherin在癌細(xì)胞中低表達(dá)。有研究者使用免疫組化檢測(cè)170例食管鱗狀細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的正常食管黏膜組織中E-cadherin的表達(dá)情況，食管鱗狀細(xì)胞癌組E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，E-cadherin表達(dá)的陽(yáng)性率與分化等級(jí)、腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段顯著相關(guān)[18]。對(duì)78例經(jīng)過保乳手術(shù)治療的乳腺癌患者進(jìn)行研究，將有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳腺癌患者保乳術(shù)后腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與E-cadherin表達(dá)降低有一定的相關(guān)性[19]。本實(shí)驗(yàn)使用免疫組化檢測(cè)E-cadherin在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示E-cadherin在癌組織中陽(yáng)性率低于癌旁組織。E-cadherin的表達(dá)與miR-221的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示miR-221高表達(dá)組與miR-221低表達(dá)組的生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，miR-221在腎細(xì)胞癌中表達(dá)升高且與臨床Fuhrman分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-221與EMT相關(guān)分子E-cadherin的表達(dá)有相關(guān)性。本研究表明miR-221在腎透明細(xì)胞癌EMT進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用，是腎透明細(xì)胞癌患者生存及預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。