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      八寶景天總黃酮的提取純化及抗氧化抑菌活性的研究進(jìn)展

      2023-03-24 05:59:54鄭樂(lè)樂(lè)錢(qián)義慧馬麗君張雙雙
      農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年22期
      關(guān)鍵詞:景天八寶大孔

      鄭樂(lè)樂(lè),錢(qián)義慧,馬麗君,張雙雙,李 娜

      (宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽 宿州 234000)

      八寶景天(Hylotelephium erythrostictum),別名蝎子草、長(zhǎng)藥景天、華麗景天,是一種可以為藥用的、名為八寶的草藥。又名“八寶”“胡豆七”“活血三七”等,屬于景天科八寶屬的草本植物,其葉子肥大,根莖粗壯,根莖、葉子及花朵都可以入藥,并且一年四季都可以隨時(shí)采摘,但更多的人喜歡用新鮮的八寶景天來(lái)入藥。八寶景天在《海藥本草》 《開(kāi)寶本草》 《本草綱目》等中醫(yī)學(xué)典籍中均有記載,在東北、河北、湖北、江蘇、浙江、安徽、河南、四川、貴州、云南、山西等地都有大量栽種,而且生長(zhǎng)狀況良好,是一種極易栽培、生長(zhǎng)范圍很廣的植物。八寶景天無(wú)論在生物學(xué)上還是在化學(xué)上,其性質(zhì)均很穩(wěn)定、口感較為苦澀,并帶有略微的酸味。此外,八寶景天還有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、促進(jìn)皮膚血液循環(huán)、止痛止血的作用。經(jīng)過(guò)對(duì)八寶景天深入研究,發(fā)現(xiàn)其及其提取物中含有非常復(fù)雜、豐富且多元化的生物功能性物質(zhì),其中包括各種天然活性生物堿、甾體、鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)化合物及其衍生物、縮合單寧和生氰化合物等,使得黃酮類(lèi)化合物在醫(yī)療應(yīng)用方面的成效非常顯著。

      黃酮類(lèi)化合物(Flavonoids 或flavonoes compounds) 是指基本母核為2- 苯基色原酮的類(lèi)化合物,具有一個(gè)由中間的吡喃或吡喃酮環(huán)(C) 連接的2 個(gè)苯環(huán)(A 和B) 的三環(huán)核心,是一大類(lèi)的次生代謝產(chǎn)物,在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中所形成,在植物群落中有大量的存在。目前,已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了近萬(wàn)種植物中含有類(lèi)黃酮類(lèi)成分,并且類(lèi)黃酮的種類(lèi)已經(jīng)超過(guò)了5 000 種,其中最為常見(jiàn)的是:二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)、異黃酮和黃酮醇類(lèi)、黃烷醇類(lèi)、花色素類(lèi)、雙黃酮類(lèi)、查耳酮類(lèi)及其他黃酮類(lèi)。雖然大多數(shù)的類(lèi)黃酮都可以與糖基化合成糖苷,但是也有一些是以游離狀態(tài)存在。黃酮類(lèi)化合物的藥理作用多種多樣,已被大量的試驗(yàn)研究證實(shí),其藥理作用有抗氧化、消炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、抗抑郁、抗心腦血管疾病、抗糖尿病及其并發(fā)癥、調(diào)血脂及提高免疫力等。

      八寶景天作為一種觀賞性植物,在園林綠化中得到了廣泛的應(yīng)用,然而關(guān)于八寶景天更高的藥用價(jià)值,特別是其黃酮類(lèi)物質(zhì)的有效提取、分離、純化及其抗氧化、抑菌作用的深入研究寥寥無(wú)幾?,F(xiàn)綜述八寶景天總黃酮的提取工藝、總黃酮經(jīng)大孔樹(shù)脂純化的最優(yōu)分離條件,以及八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌作用的生物活性。

      1 總黃酮的提取

      1.1 超聲提取法

      超聲波萃取是一種有效成分的提取方法,在中藥活性成分的提取中被廣泛應(yīng)用。超聲提取技術(shù)是將高能超聲注入到提取體系中,使體系內(nèi)形成無(wú)數(shù)個(gè)小孔并快速閉合,當(dāng)小孔閉合時(shí),將會(huì)產(chǎn)生瞬間高壓,推動(dòng)超聲提取加快提取速度。通過(guò)介質(zhì)吸收超聲波并產(chǎn)生內(nèi)摩擦,使其產(chǎn)生強(qiáng)烈的振動(dòng),通過(guò)這個(gè)過(guò)程,使超聲振動(dòng)的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為介質(zhì)內(nèi)能。同時(shí),介質(zhì)的溫度和植物天然產(chǎn)物組織的內(nèi)部溫度也會(huì)逐步升高,導(dǎo)致2 種壓力均可引起試樣表面的變形和破壞。此外,溶劑和樣品粒子之間存在不同的加速度,二者之間產(chǎn)生的摩擦?xí)?dǎo)致2 個(gè)碳原子之間的碳碳雙鍵發(fā)生斷裂,導(dǎo)致聚合物的裂解。超聲提取對(duì)象物質(zhì)的方法主要有3 種機(jī)理,即熱空化學(xué)作用、熱作用和機(jī)械作用,這3 種機(jī)理被廣泛應(yīng)用于超聲提取技術(shù)中。將超聲波萃取技術(shù)應(yīng)用于植物活性成分的提取過(guò)程中,不僅能節(jié)省能源,還能有效地提高提取效果。

      1.2 酶解法

      一些特定的酶類(lèi)可以在一定程度上促進(jìn)某些特定的化學(xué)反應(yīng),使其具有較高的反應(yīng)效率和較高的產(chǎn)物活性。酶解法是將蛋白質(zhì)的肽鍵或胺鍵進(jìn)行特定的水解,蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后,其極性基團(tuán)數(shù)目增加,肽鏈長(zhǎng)度變短,肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量下降,使蛋白質(zhì)的溶解性增強(qiáng),功能形狀也會(huì)隨之變化,細(xì)胞壁或者蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)合物被破壞,目標(biāo)產(chǎn)物——總黃酮類(lèi)化合物被釋放。由于植物細(xì)胞壁主要由一種可溶于水的纖維素構(gòu)成,且含有少量的果膠,因此在大量的試驗(yàn)中,人們常采用木質(zhì)素(Lignose) 抑制劑或多聚果膠酶(Polypectinase) 抑制劑,將細(xì)胞壁組分直接氧化降解,以獲得細(xì)胞膜包裹的胞漿系統(tǒng)物質(zhì)。破壁后,對(duì)提取活性物質(zhì)和有機(jī)溶劑的萃取具有極大的促進(jìn)作用。

      1.3 酶法輔助超聲提取

      通常用于試驗(yàn)研究的萃取法,其具有簡(jiǎn)便、快速和安全等特點(diǎn),然而任何方法都具有兩面性,該方法存在提取時(shí)間長(zhǎng),提取效率低等問(wèn)題。針對(duì)這一問(wèn)題,擬以八寶景天為對(duì)象,利用適宜的酶和適宜的超聲能量,在有機(jī)溶劑中高效提取其有效成分。利用響應(yīng)曲面(Box-behnken) 法建立酶輔助超聲波的優(yōu)化模型,確定酶輔助超聲波的最優(yōu)條件,實(shí)現(xiàn)快速、溫和的提取。在Box-behnken 模型中,能夠更清楚地看到每個(gè)因素對(duì)反應(yīng)值的影響,為八寶景天中總黃酮的深層次開(kāi)發(fā)利用提供參考。

      呂凱波等人[1]在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)酶輔助超聲波法的最佳條件為超聲功率100 W,料液比1∶17(g∶mL),超聲處理時(shí)間32 min,纖維素酶添加量約為2.6%,超聲酶解持續(xù)時(shí)間49 min,試驗(yàn)證明,該方法提取的總黃酮含量可達(dá)14.01%,該方法提取的活性成分具有(89.9±0.06) %的抗·OH 能力,研究發(fā)現(xiàn),與水煎法、回流法、酶法、超聲波法等相比較,酶輔助超聲波法在提取液中的活性成分含量要高出10%以上,超聲波與酶法結(jié)合提取的活性物質(zhì)表現(xiàn)出了較好的抗氧化性,該活性物質(zhì)的DPPH·、·OH 清除率都可提高20%以上。唐文文等人[2]利用超聲波乳化結(jié)合雙酶(纖維素酶、果膠酶) 快速高效地提取了當(dāng)歸表層部位中的總黃酮,最佳的提取工藝為酒精體積分?jǐn)?shù)小于50%,料液比大于50∶1,超聲波提取時(shí)間大于41 min,雙酶量地濃度比(纖維素酶∶果膠酶= 2∶1) >0.68 g/L,酶的完全水解所需地超聲波時(shí)間大約是93 min,在以上5 個(gè)最基本的水解條件下,從當(dāng)歸地表部位中提取的總黃酮的提取率達(dá)到了8.18%。孟永海等人[3]利用單因素試驗(yàn),對(duì)乙醇萃取主要藥物所使用酶的含量百分?jǐn)?shù)及主要藥物用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶液pH 值、料液分配體積比、萃取溫度及時(shí)間、超聲溫度、時(shí)間及功率等進(jìn)行了研究,并對(duì)萃取方法的影響進(jìn)行了探討;以上述結(jié)果為依據(jù),應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)酶法輔助超聲法提取刺玫果實(shí)中總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,最終得到了總黃銅的最佳提取方案為纖維素酶用量15 mg/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,溶液pH 值5,藥物∶乙醇= 1∶15(g∶mL),提取溫度50 ℃,提取時(shí)間2.0 h,超聲提取輔助加熱功率為450 W,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間40 min,刺玫果實(shí)提取物中的總黃酮提取率為128.6 mg/g。

      2 黃酮類(lèi)化合物的分離純化

      采用酶輔助超聲波萃取的粗提物,其組分非常復(fù)雜,可能會(huì)影響后續(xù)八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌活性研究。另外,粗提物中總黃酮的相對(duì)含量偏低,不能滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。因此,需對(duì)粗提物進(jìn)行提純處理。為了得到較高的純度,在分離純化過(guò)程中,一般都會(huì)使用大孔樹(shù)脂吸附的方法以得到更高純度的提取液。

      大孔樹(shù)脂吸附法與其他吸附法相比,大孔樹(shù)脂的吸附提純能夠在每單位質(zhì)量的物質(zhì)上提供更大的總面積(比表面積),并具有更大的吸附容量、更好的選擇性、更快的吸附速度等諸多優(yōu)點(diǎn)。大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)具有高選擇性、高穩(wěn)定性的固體分離材料。大孔樹(shù)脂特殊的三維立體多級(jí)孔結(jié)構(gòu),增大了分粗提取液與大孔吸附樹(shù)脂之間的接觸面積,使其具有更大的范德華引力,并可形成更多的氫鍵作用,這樣可以將來(lái)自極低濃度溶液的目標(biāo)有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行吸附。由于大孔樹(shù)脂在3D 空間中具有不同尺寸的立構(gòu)孔道,使其在溶液流經(jīng)大孔樹(shù)脂時(shí),不同分子在孔道中的穿透力存在較大差異,進(jìn)而影響其對(duì)溶液的吸附速度。在利用大孔樹(shù)脂對(duì)粗提取液純化的過(guò)程中,可以將具有不同吸附力和不同分子量尺寸的有機(jī)化合物吸附在樹(shù)脂上,然后用不同的溶劑洗脫,從而實(shí)現(xiàn)精細(xì)的分離和提純[18]。

      2.1 大孔樹(shù)脂的分類(lèi)及常見(jiàn)型號(hào)

      將大孔樹(shù)脂按照其極性大小及所選擇的小分子與分子間以共價(jià)鍵結(jié)合形成聚合物的小分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別,將其劃分為三大類(lèi):非極性大孔吸附樹(shù)脂、極性大孔吸附樹(shù)脂,以及中極性大孔吸附樹(shù)脂[19]。大孔樹(shù)脂的種類(lèi)繁多,而且每一種樹(shù)脂的型號(hào)都不一樣,不同類(lèi)型和型號(hào)的大孔樹(shù)脂,其吸附特性也會(huì)有很大的差異。目前,我國(guó)有南開(kāi)大學(xué)化學(xué)研究所生產(chǎn)的AB、D、H 系列,上海制藥研究所生產(chǎn)的SIP系列等。

      2.1.1 非極性大孔樹(shù)脂

      非極性大孔吸附樹(shù)脂又被稱(chēng)為芳香性吸附劑,如苯乙烯,二乙烯苯等,有很小的轉(zhuǎn)矩用來(lái)收集單倍體。由于其主鏈結(jié)構(gòu)中不含有任何功能性堿基,因此非極性大孔樹(shù)脂表面具有較強(qiáng)的疏水性,但對(duì)有機(jī)溶劑中的疏水性組分具有較強(qiáng)的吸附能力。最適宜的是在極性溶劑中對(duì)非極性物質(zhì)(如水) 進(jìn)行吸附,而在極性溶劑中對(duì)小分子的疏水性部分則會(huì)產(chǎn)生分子作用。在實(shí)驗(yàn)室中常用的模型有XAD-1600,D-101,D3520,HP-20,CAD-40 等[20]。

      2.1.2 中等極性大孔樹(shù)脂

      中極性大孔樹(shù)脂是以多官能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑的一種含有酯基的大孔樹(shù)脂,將其包裹在含醚基的整體中,并與多孔層相結(jié)合,其表面包括排水和剖面兩部分。中性多孔吸附樹(shù)脂可以從極性溶液中吸收非極性物質(zhì),也可以將非極性溶液中的大多數(shù)極性物質(zhì)吸出,還可以將其作為脂族吸附劑,如聚丙烯酸酯類(lèi)聚合物。中極性大孔樹(shù)脂在工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)中較常用的大孔樹(shù)脂類(lèi)型有LX-28,ADS-45,BS-45,BS-45,BS-45,BS-45,BS-75 等[21]。

      2.1.3 極性大孔樹(shù)脂

      極性大孔樹(shù)脂(Polymer porous gap resin) 主要由含有酰胺基、氰基、酚羥基的樹(shù)脂組成,其中有的樹(shù)脂還可利用靜電作用對(duì)極性物質(zhì)進(jìn)行吸附,如丙烯酰胺。XAD-10、XAD-11、AD-12、NAK-9、DouliteXAD-761 等[19]都屬于極性大孔樹(shù)脂。

      2.2 大孔吸附樹(shù)脂在總黃酮純化中的應(yīng)用

      侯夢(mèng)陽(yáng)等人[7]采用比較試驗(yàn)對(duì)NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 等型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂的制備及其對(duì)玳玳花總黃酮的吸附、解析力進(jìn)行了測(cè)定,得出AB-8 型的提純效果最好;楊永濤[8]以3 個(gè)主要的孔解吸附速率樹(shù)脂為主要原料,通過(guò)對(duì)6 中樹(shù)脂(AB-8、D101、S-8、X-5、HPD-500NKA-9) 的吸附速率的比較,從羅布麻中篩選出高效的HPD-500 樹(shù)脂。荊常亮[9]的研究表明AB-8 型大孔樹(shù)脂是從草本植物中提取和提純總黃酮的最好方法,其純度可達(dá)79.62%。鄧夢(mèng)琴[10]用NKA 型大孔樹(shù)脂對(duì)菠蘿蜜中的總黃酮進(jìn)行富集純化,其總黃酮含量從16.74%上升到了84.42%。敬思群[11]使用AB-8 型大孔樹(shù)脂對(duì)昆侖雪菊中的總黃酮進(jìn)行了分離純化,結(jié)果表明,總黃酮含量由28.12%增加到52.43%,增加了86.5%。王雯[12]用D-312 型大孔樹(shù)脂對(duì)化橘紅中總黃酮進(jìn)行了分離純化,結(jié)果表明化橘紅中總黃酮的含量從14.16%上升至53.5%,在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了上樣溶液pH 值為4、吸附流速1.0 mL/min 的洗脫條件下,pH 值為7,洗脫流速為1.0 mL/min,洗脫溶液體積含量為80%。庫(kù)詠峰[13]通過(guò)對(duì)9 種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附以及動(dòng)態(tài)吸附的比較,發(fā)現(xiàn)HPD-500 型大孔樹(shù)脂的吸附性能比其他類(lèi)型大孔樹(shù)脂更好,能夠使肉桂中總黃酮的提取率達(dá)到91.81%。林志欽[14]使用X-5 型大孔樹(shù)脂,對(duì)蓮子芯中的總黃酮化合物進(jìn)行了分離與純化,并確定了其最佳提純工藝:上樣質(zhì)量濃度5.1 mg/mL,上樣pH 值6,上樣流速為物料的2 倍體積每小時(shí),上樣量為物料的2 倍體積,洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇,洗脫流速為物料的2 倍體積每小時(shí),洗脫劑用量為4 倍體積。

      3 總黃酮的生物活性

      3.1 抗氧化活性

      黃酮類(lèi)物質(zhì)具有與其他抗氧化劑相似的抗氧化機(jī)制,其主要機(jī)制是產(chǎn)生氧原子,然后氧化生成多酚自由基。其氧化產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定,不容易被其他大分子所破壞,且具有良好的金屬絡(luò)合作用。這類(lèi)化合物具有高度的離域性質(zhì)、完備的的大π 鍵共軛體系,強(qiáng)配體和適宜的立體結(jié)構(gòu)等特點(diǎn),是一類(lèi)非常理想的金屬離子配體。已有的研究表明,類(lèi)黃酮金屬絡(luò)合物可顯著提高材料的抗氧化性。黃酮不但能抑制脂肪氧酶和NADH 氧化酶等酶的活力,起到抗氧化效果,還能使黃酮類(lèi)化合物的抗氧化性能得到全面提高。梁證等人[22]采用AB-8 型大孔樹(shù)脂提純了仙人掌的果皮和果肉中的總黃酮,證明了仙人掌的抗氧化性。楊永濤[23]對(duì)羅布麻中總黃酮的大孔樹(shù)脂純化物產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,大孔樹(shù)脂純化產(chǎn)物對(duì)DPPH·,·OH,O2-·,ABTS+·等都有一定的清除作用,其抗氧化性比總黃酮粗提物強(qiáng)。吳婕等人[24]研究結(jié)果顯示,在甜茶葉中總黃酮的質(zhì)量濃度相同的情況下,經(jīng)提純后的總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除率降低了28.6%,結(jié)果表明,經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的甜茶葉總黃酮具有更強(qiáng)的抗氧化能力。王寒冬[25]研究發(fā)現(xiàn),DM130 型大孔樹(shù)脂對(duì)趕黃草黃酮具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力,并具有較強(qiáng)的還原能力。

      3.2 抑菌活性

      杜銀香等人[26]采用大孔樹(shù)脂法從華中枸骨葉中分離得到了一種有效成分,初步證明該成分具有一定的體外抗菌活性,且隨著該成分的含量的增加,其抗菌活性也隨之增強(qiáng)。賴(lài)譜富等人[27]在研究過(guò)程中,采用大孔樹(shù)脂分離純化了多年生藤本豆的總黃酮,結(jié)果表明,多年生藤本豆的總黃酮抗菌活性隨其濃度的增大而增大。孫丹丹[28]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),凍綠葉黃酮溶液種類(lèi)相同的情況下,不同濃度的凍綠葉黃酮溶液的抑菌效果有明顯差異。龍旭等人[29]研究表明,丹參總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均有較強(qiáng)的抑菌效果,且對(duì)革蘭氏菌也有較強(qiáng)的抑菌效果,但在相同濃度丹參總黃酮的條件下,其抑菌效果具有明顯的大小差異:大腸桿菌>金葡菌>綠膿桿菌,說(shuō)明丹參總黃酮對(duì)細(xì)菌有較好的抑制作用。劉芮等人[30]在前期工作中發(fā)現(xiàn),銀杏黃酮提取物可延長(zhǎng)3 種致病菌(金葡菌、大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌) 的感染延遲期,銀杏黃酮作用8 h 后,3 種致病菌細(xì)胞破裂,內(nèi)容物泄露;3 種致病菌在銀杏黃酮提取物處理4~12 h 后,其3 種致病菌菌液中的AKP 酶活性明顯升高;銀杏黃酮可是病原菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS) 升高,表明其可能是病原菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,使其失去存活能力。邵方宣[31]的研究表明,北橐吾總黃酮溶液在處理3 h后,能夠與Ecolid 的細(xì)胞成分相結(jié)合,破壞其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性,引起Ecoli 細(xì)胞形態(tài)的顯著改變。另外,北橐吾總黃酮還能改變Ecoli 細(xì)胞膜的滲透性,嚴(yán)重時(shí)會(huì)將Ecoli 細(xì)胞膜徹底破壞,造成Na+、K+、DNA 等物質(zhì)的大量外流,試驗(yàn)總結(jié)了黃酮類(lèi)化合物的抗菌活性,黃酮類(lèi)化合物能夠通過(guò)干擾細(xì)菌體內(nèi)DNA 的作用,影響體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)的平衡狀態(tài),甚至?xí)茐哪繕?biāo)菌的細(xì)胞膜,改變細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞中ROS 含量等,從而起到抑菌的效果。

      4 結(jié)語(yǔ)

      擬利用Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì),通過(guò)雙酶輔助超聲波的方法,以八寶景天中總黃酮類(lèi)化合物為研究對(duì)象,在降低其他因素干擾的同時(shí),得到最佳的提取工藝,并極大地提高了總黃酮成分的提取率。通過(guò)對(duì)大孔樹(shù)脂吸附、分離和提純工藝的研究,不僅可以提高總黃酮的純度,還能夠去除粗提物中的雜質(zhì),也能增強(qiáng)總黃酮的生物活性。近年來(lái),隨著總黃酮化合物的提取和分離,以及對(duì)總黃酮化合物抗氧化和抑菌作用的研究,得到了廣泛的關(guān)注和深入,對(duì)八寶景天總黃酮的提取方法、大孔樹(shù)脂的純化方法及經(jīng)純化后的總黃酮抗氧化和抑菌活性進(jìn)行了綜述,以期為今后八寶景天總黃酮化合物的開(kāi)發(fā)和利用提供一定的參考。

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