重癥新生兒呼吸窘迫綜合征早產(chǎn)兒的SFTPA基因多態(tài)性分析

袁 嬌，王永明，顧 潔

新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)是一種以呼吸衰竭和氣體交換改變?yōu)樘卣鞯亩嘁蛩丶膊?，早產(chǎn)兒肺發(fā)育不成熟引起的肺表面活性物質(zhì)(PS)合成缺乏是主要病因[1]。肺表面活性蛋白(SP)是PS的主要成分，可維持正常的肺功能，SP分為SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 4種蛋白，其中SP-A通過結(jié)合脂質(zhì)表面的碳水化合物部分維持著PS的穩(wěn)態(tài)[2-3]。研究表明，編碼SP蛋白相關(guān)基因的致病性變異支持了RDS與遺傳因素密切相關(guān)[4-5]。編碼SP-A的SFTPA基因位于10q21.3，該基因位點(diǎn)突變可通過影響SP-A蛋白功能增加RDS的易感性[3]。目前，國內(nèi)外對于患有重癥RDS的早產(chǎn)兒中SFTPA基因變異情況了解甚少，本研究對胎齡在28周(含)至32周(含)之間、患有重癥RDS的早產(chǎn)兒進(jìn)行SFTPA基因編碼區(qū)和內(nèi)含子連接區(qū)高通量測序。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2019年5月至2022年1月在寧夏銀川市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室收住的早產(chǎn)兒。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡在28周(含)至32周(含)的早產(chǎn)兒；②重癥RDS患者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在先天性遺傳代謝病者；②存在宮內(nèi)窘迫或生后窒息者；③其母存在妊娠糖尿病者；④多胎。

1.2 RDS診斷標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)W洲頒布的指南[6]：出生后不久出現(xiàn)呼吸急促，大于60次/min，伴有呻吟、三凹征，呼吸困難呈進(jìn)行性加重，吸空氣時(shí)PaO2小于50 mmHg,伴有中心性發(fā)紺，吸氧后才能維持PaO2大于50 mmHg；符合RDS特征性胸片改變：可見網(wǎng)格、顆粒狀陰影，支氣管充氣征，“白肺”，RDS的嚴(yán)重程度基于新生兒醫(yī)生的臨床判斷，其治療方法為經(jīng)無創(chuàng)通氣及單次外源性表面活性物質(zhì)治療，無效改用有創(chuàng)常頻機(jī)械通氣、高頻機(jī)械通氣(HFOV)或給予2次以上外源性表面活性物質(zhì)治療。對所有受試者征得家屬同意后均進(jìn)行基因檢測，本研究獲銀川市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 研究方法:①血樣采集。抽取患兒的靜脈血2mL，放于EDTAK2管后保存在-80℃冰箱，通過干冰運(yùn)輸至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行檢測。②核酸提取及質(zhì)控。采用實(shí)驗(yàn)室自配試劑紅細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L MgCl2，1%TritonX-100)及核裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，400 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，0.8 mol/L鹽酸胍)進(jìn)行核酸提取，核酸質(zhì)量檢測：使用1%濃度的瓊脂糖凝膠在150 V電壓下電泳約40 min，主要檢測樣品完整性、是否存在RNA或者蛋白及次生代謝物污染；DNA純度檢測：利用Nanodrop進(jìn)行DNA純度檢測(A260/A280比值)，一般OD值在1.8～2.0 ，含量在1μg以上的DNA樣本用于后續(xù)建庫。③文庫構(gòu)建。DNA質(zhì)控合格后會對其進(jìn)行打斷、末端修復(fù)、加“A”、加 DNBseq 測序儀特有接頭，并且通過 PCR 富集構(gòu)建DNA文庫。④上機(jī)測序。將制備好的 DNB 加載到微陣列芯片(Patterned Array)上，使用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS，Combinatorial Probe-Anchor Synthesis)進(jìn)行測序，將測序引物錨定分子和熒光探針在 DNA 納米球上進(jìn)行聚合反應(yīng)之后，利用高分辨成像系統(tǒng)對光信號進(jìn)行采集、讀取和識別，獲得單個(gè)堿基序列信息，然后進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)獲得下一個(gè)堿基序列信息。⑤生物信息分析。采用以下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾：切除接頭序列和兩端低質(zhì)量堿基后長度小于 35bp 的 reads；去除 N(N 表示無法確定堿基信息)堿基含量 5% 以上的 reads；去除單端 reads 中低質(zhì)量堿基數(shù)(質(zhì)量值 Q≤ 15)占整條 read 長度比例 40% 以上的 reads。本研究主要基于 GRCh37 版本參考基因組進(jìn)行分析，參考gnomAD 數(shù)據(jù)庫(Genome Aggregation Database) 及ESP(NHLBI Exome Sequencing Project)、ExAC、EAS_1000g對SNP變異頻率數(shù)據(jù)庫注釋。

2 結(jié)果

2.1 重癥RDS患兒的臨床特點(diǎn)及SFTPA基因變異分析:在研究期間共納入胎齡在28周(含)至32(含)周患有RDS的早產(chǎn)兒42例，其中存在重癥RDS患兒20例，胎齡為28+1～32周，出生體重為1 030 g～1 585 g，所有患兒入院后予NCPAP輔助通氣及PS替代治療后效果不佳，后均予有創(chuàng)機(jī)械通氣治療(呼吸機(jī)模式主要為SIMV、PC-AC及HFOV)，其中6例給予第2劑PS治療，1例給予第3劑PS替代治療。5例患兒出院后死亡(最小月齡為2月，最大月齡6月)，其余均存活。20例進(jìn)行SFTPA基因測序早產(chǎn)兒中，19例患兒檢出基因位點(diǎn)變異，變異頻率為95%，共檢出13個(gè)位點(diǎn)變異，見表1。

表1 重癥RDS患兒的臨床特點(diǎn)及SFTPA基因變異分析

2.2 重癥RDS患兒SFTPA基因變異位點(diǎn)分布:在13個(gè)SFTPA基因變異位點(diǎn)中，編碼區(qū)檢出變異位點(diǎn)8個(gè)，分別為c.193C>G、c.597T>C、c.162C>T、c.231A>G、c.700C>T、c.449G>A、c.683G>C、c.465C>T，內(nèi)含子區(qū)變異位點(diǎn)5個(gè)，分別為c.-38-44C>T、c.337+45del、c.22+24A>T、c.-35G>T、c.-38-30G>C，其中變異位點(diǎn)主要分布在第3、4、6外顯子區(qū)域，經(jīng)查閱數(shù)據(jù)庫 EAS_1000g，ExAC/gnomAD，獲取位點(diǎn)變異頻率，見表2。

表2 重癥RDS患兒SFTPA基因變異位點(diǎn)頻率分布

2.3 罕見變異位點(diǎn)致病性預(yù)測分析:本研究采用保留 EAS_1000g千人基因組數(shù)據(jù)庫中MAF<1%的變異，AF_EAS_exac:ExAC；AF_eas_gnomade:gnomAD exomes中AF<1%的變異的方法進(jìn)行變異位點(diǎn)過濾篩選。從8個(gè)變異位點(diǎn)中初步篩選出c.683G>C及c.-38-30G>C 2個(gè)潛在可能致病性變異，c.683G>C基因位點(diǎn)位于6號外顯子，為雜合變異，將該位點(diǎn)輸入InterVAR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行變異位點(diǎn)有害性分析，結(jié)果顯示該位點(diǎn)為“致病性不明確位點(diǎn)”，將變異位點(diǎn)錄入varcards數(shù)據(jù)庫模擬預(yù)測蛋白功能，結(jié)果顯示該變異位點(diǎn)的氨基酸保守性(Sorting Intolerant From Tolerant，SIFT)為Tolerable(0.766)，蛋白結(jié)構(gòu)功能進(jìn)化保守性(Polymorphism Phenotyping v2，PP2)、Mutation Taster、(Protein Variation Effect Analyzer，PROVEAN ) 預(yù)測結(jié)果分別為Benign(0.0)、Polymorphism(1)、Tolerable(3.63)，見表3。

表3 罕見SFTPA基因變異位點(diǎn)分析

2.4 內(nèi)含子區(qū)變異位點(diǎn)致病性預(yù)測分析:SFTPA基因上檢出的c.-38-30G>C變異位點(diǎn)是該基因2號內(nèi)含子上的雜合變異，采用NETGene2V.2.4軟件對該內(nèi)含子變異位點(diǎn)進(jìn)行剪切位點(diǎn)影響行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示c.-38-30G>C變異前(圖1，封三)和變異后(圖2，目錄后)對剪切位點(diǎn)沒有影響。

3 討論

PS包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D四種蛋白，其相關(guān)編碼基因突變均與RDS相關(guān)，肺表面活性蛋白A(SP-A)為長約26-36Da的多聚糖蛋白，由248個(gè)氨基酸殘基組成。SP-A主要與先天性免疫和表面活性劑功能有關(guān)，其可以結(jié)合脂質(zhì)表面的碳水化合物部分，維持表面活性物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[7]，并調(diào)節(jié)磷脂的插入以及肺泡Ⅱ型細(xì)胞對磷脂的攝取和分泌[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SP-A缺乏會影響正常的肺功能和表面活性物質(zhì)代謝[9-10]，SP-A表達(dá)水平可影響胎兒肺成熟度，將來可能作為RDS檢測的新型標(biāo)志物[11]。本文對上述編碼基因進(jìn)行外顯子測序，并進(jìn)行生物信息分析未發(fā)現(xiàn)SFTPB、SFTPC、SFTPD存在基因變異，僅編碼SP-A蛋白的SFTPA基因出現(xiàn)位點(diǎn)變異。

編碼SP-A蛋白的基因SFTPA位于10q22.3，其全長4.5 kb，包含(7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子)，一項(xiàng)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法對北京地區(qū)100例伴有RDS的早產(chǎn)兒進(jìn)行SFTPA:c.+186A/G和c.+655C/T基因位點(diǎn)的多態(tài)性檢測研究，發(fā)現(xiàn)病例組和對照組在c.+186A/G、c.+655C/T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率上存在顯著差異，SFTPA基因的多態(tài)性參與了早產(chǎn)兒RDS的發(fā)生，其中c.+186A/G的AA基因型與RDS風(fēng)險(xiǎn)的增加呈獨(dú)立相關(guān)關(guān)系[3]。Abuelhamed WA對開羅地區(qū)65 名患有RDS的早產(chǎn)兒通過實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)SFTPA基因c.751G>A單核苷酸多態(tài)性與RDS有關(guān)[12]。新春等針對內(nèi)蒙古地區(qū)50例RDS早產(chǎn)兒進(jìn)行SFTPA:c.56T>C及c.148C>G位點(diǎn)多態(tài)性分析[13]，發(fā)現(xiàn)蒙古族兒童兩位點(diǎn)的等位基因及等位基因頻率與RDS發(fā)生無關(guān)。以上均證實(shí)不同地區(qū)SFTPA基因多態(tài)性存在差異，但目前國內(nèi)外研究均未針對患有重癥RDS的早期早產(chǎn)兒進(jìn)行SFTPA基因分析，本文在對寧夏地區(qū)20例(28周≤胎齡≤32周)，患有重癥RDS的早產(chǎn)兒的SFTPA基因進(jìn)行全外顯子高通量測序，發(fā)現(xiàn)13個(gè)變異位點(diǎn)，但本研究中4名回族及16名漢族兒童的SFTPA:c.+186A/G、c.+655C/T、c.751G>A、c.56T>C及c.148C>G均為野生型，但在2名漢族早產(chǎn)兒的SFTPA基因出現(xiàn)編碼區(qū)第6外顯子的c.683G>C和第2內(nèi)含子c.-38-30G>C位點(diǎn)變異，通過查閱亞洲人群相關(guān)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)變異位點(diǎn)變異頻率分別為0和0.006(1000 Genomes)，再采用變異位點(diǎn)有害性預(yù)測工具(InterVAR數(shù)據(jù)庫及varcards數(shù)據(jù)庫)對變異位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測及有害性分析，結(jié)果顯示c.683G>C位點(diǎn)為意義不明變異。此外，應(yīng)用NETGene2V.2.4軟件對SFTPA基因內(nèi)含子變異位點(diǎn)c.-38-30G>C對該基因剪切位點(diǎn)的影響進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示c.-38-30G>C變異對剪切位點(diǎn)沒有影響。本研究將針對c.683G>C和c.-38-30G>C變異位點(diǎn)對SFTPA基因的表達(dá)及調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步分析。

綜上所述，本研究顯示患有重癥RDS的早期早產(chǎn)兒存在SFTPA基因位點(diǎn)變異，但其致病性尚不明確，今后將繼續(xù)加大本地區(qū)RDS樣本量的檢測，同時(shí)測定SP-A蛋白表達(dá)水平，以期進(jìn)一步明確SFTPA基因上c.683G>C和c.-38-30G>C變異位點(diǎn)對重癥RDS早產(chǎn)兒的影響。