TIPE2 在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的表達和意義

齊建軍，楊麥青，張林，汪釗，王艷峰

（1.昌邑市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 昌邑 261300；2.昌邑市人民醫(yī)院病理科，山東 昌邑 261300；3.濰坊市人民醫(yī)院/濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261041；4.北大荒集團總醫(yī)院病理科，黑龍江 哈爾濱 150088）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma）是指腎臟上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，是全世界最常見的腫瘤之一。據(jù)報道[1]，2021 年美國有76 080 例新病例和13 780例死亡病例，近幾年腎細(xì)胞癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常見的腎細(xì)胞癌亞型，約占腎細(xì)胞癌的70%[2]。目前，手術(shù)治療對局限性ccRCC患者是最有效的治療方式[3]。CcRCC 常伴有von Hippel-Lindau（VHL）基因缺失或突變，隨著個體化靶向治療的發(fā)展，多靶點酪氨酸激酶抑制劑（TKI）和雷帕霉素哺乳動物靶點（mTOR）抑制劑的應(yīng)用已成為ccRCC 治療的重大突破[4]。盡管在癌癥研究和藥物研發(fā)方面取得了重大進展，但對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的ccRCC 患者目前尚無有效的治療手段，ccRCC 伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者生存率仍然很低[4，5]。因此，尋找該病早期診斷、治療和評估預(yù)后的有效分子靶標(biāo)意義重大。腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白8（TNFAIP8）樣蛋白家族由4 個成員組成，即結(jié)構(gòu)高度相似的TNFAIP8、TIPE1、TIPE2 和TIPE3。它們在不同的生物學(xué)行為中發(fā)揮不同的作用，并參與癌癥發(fā)生發(fā)展的過程[6，7]。TIPE2 位于染色體1q21.2-1q21.3，TIPE2 主要在淋巴組織和骨髓組織中表達[7，8]，參與機體細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。并與炎癥、自身免疫病、腫瘤等疾病的進展密切相關(guān)[9，10]。研究表明[11-13]，TIPE2 在結(jié)腸癌、肺癌、腎癌組織中呈高表達。另外，在胃癌、肺癌中TIPE2 的表達卻明顯降低[14，15]。本文主要探討TIPE2對ccRCC 增殖和侵襲過程中的作用，分析TIPE2 對Wnt 信號通路關(guān)鍵蛋白的影響，以期為ccRCC 的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 數(shù)據(jù)庫：利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）在線數(shù)據(jù)庫獲取和分析TIPE2 在ccRCC 和正常腎組織中的表達差異和患者預(yù)后評估。細(xì)胞：本研究所用ccRCC 細(xì)胞786-O 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，按照細(xì)胞庫官方網(wǎng)站提供的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 TIPE2 的數(shù)據(jù)庫資料分析 TIPE2 在ccRCC 和正常腎組織中表達情況和臨床病理資料等數(shù)據(jù)來源于在線數(shù)據(jù)庫UALCAN。在預(yù)后分析中，將獲取樣本分為高表達組（TPM 值高于上四分位數(shù)）和低/中表達組（TPM 值低于上四分位數(shù)）。具體操作步驟：進入主頁后輸入TNFAIP8，在TCGA datase 對話框內(nèi)找到透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌；在新打開的頁面點擊expression，然后在對話框內(nèi)選擇Sample types，將圖保存；在expression 界面再次選擇Nodal Metastasis status，保存圖片；返回上一頁面，點擊survival，圖片保存。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將786-O 細(xì)胞放入六孔板并置于37 ℃含5.0%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞密度達80%～90%。pCMV6-TIPE2 質(zhì)粒、對照空載體pCMV6質(zhì)粒、TIPE2 ShRNA 序列和對照shRNA 購自GENECHEM（中國上海）。取2.5 μg 質(zhì)粒根據(jù)Lipofectamine3000（Thermo Fisher Scientific，Inc.）說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 Western Blot 實驗 收集細(xì)胞加入RIPA 裂解液，提取蛋白并測定蛋白含量，取40 μg 蛋白樣品，加入SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜后在5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h，加入抗體TIPE2（1:1000，Pro teintech）、GSK3β（1:500，Proteintech）、cyclinD1（1∶500，Proteintech），β-catenin，active-β-catenin，c-Myc 和GAPDH（1∶1000，Proteintech）4 ℃冰箱過夜。第2天，與辣根過氧化物酶結(jié)合的小鼠/兔IgG（1:2000，Proteintech）在37 ℃下孵育2 h。最后用ECL（Thermo Fisher Scientific，Inc.）觀察各蛋白條帶，并拍照留存。以GAPDH 作為細(xì)胞內(nèi)蛋白對照，使用Image J1.47 軟件分析各條帶相對蛋白質(zhì)的表達水平。

1.2.4 集落形成試驗 轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞消化到6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（1000 個細(xì)胞/皿）中并培養(yǎng)14 d。PBS沖洗3 次，加預(yù)冷的甲醇固定15 min，室溫下用蘇木素染液處理10 min，利用成像儀取圖，計數(shù)超過50 個細(xì)胞的集落（直徑＞0.2 cm），使用GraphPad Prism 6.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 細(xì)胞增殖試驗 轉(zhuǎn)染24 h 后，將細(xì)胞消化到96孔板（3000 個細(xì)胞/孔，100μl 細(xì)胞懸浮液）中培養(yǎng)。24 h 后，將20 μl 的CCK-8（Dojindo Molecular Technologies，Inc.）溶液添加到每個孔中，用錫紙包裹，培養(yǎng)2 h。用分光光度法450 nm 測定細(xì)胞增殖結(jié)果。接下來的4 d 每天都在同一時間進行CCK8加藥處理，在37 ℃恒溫箱中避光孵育2 h，利用GraphPad Prism 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并按時間-吸光度（X-Y）值繪制增殖曲線。

1.2.6 基質(zhì)凝膠TM侵襲試驗 使用24 孔小室，小室底部有8 μm 孔（Costar，美國）。根據(jù)說明，在4 ℃的冰箱中提前融化基質(zhì)凝膠。以1∶7 的比例混合基質(zhì)凝膠（1∶7 稀釋，BD Biosciences，美國），放于上室中。轉(zhuǎn)染24 h 后，將1×105個細(xì)胞接種到上室（無血清培養(yǎng)基），并在下室中加600 μl 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為引誘劑。20 h 后，在室溫下用甲醇固定小室20 min，蘇木素染色10 min。隨機選擇5 個高倍視野，在顯微鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞的數(shù)量（×20）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，行t檢驗、Kaplan-Meier 進行分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIPE2 mRNA 和蛋白水平在ccRCC 和正常組織中的表達差異及TIPE2 與ccRCC 預(yù)后的關(guān)系ccRCC 組織中TIPE2 mRNA 水平和蛋白質(zhì)表達高于正常腎組織（P＜0.05），見圖1A、圖1B；另外，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）的ccRCC 相比，伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1）的ccRCC 中TIPE2 的表達升高（P＜0.05），見圖1C。根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫UALCAN 的Kaplan-Meier分析，TIPE2 高表達患者總生存期短于低表達患者（P＜0.05），見圖1D。

圖1 TIPE2 在ccRCC 中的表達及其與患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 TIPE2 對ccRCC 細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響與對照細(xì)胞相比，TIPE2 過表達增強了786-OTIPE2 細(xì)胞的增殖率和集落形成能力（P＜0.05），見圖2；相反，與對照細(xì)胞相比，ShRNA 降低TIPE2 表達并抑制了786-O-TIPE2 的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞集落形成能力（P＜0.05），見圖3；此外，與對照細(xì)胞相比，TIPE2 表達增強促進了786-O-TIPE2 細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05），相反，TIPE2 表達下調(diào)抑制了786-O-ShTIPE2 細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05）。

圖2 TIPE2 對ccRCC 細(xì)胞增殖和集落形成的影響

圖3 TIPE2 對ccRCC 細(xì)胞侵襲的影響

2.3 TIPE2 對Wnt 信號通路active-β-catenin 和靶基因的影響 在786-O 細(xì)胞（786-O-TIPE2）中通過TIPE2 基因轉(zhuǎn)染增強TIPE2 的表達，增加了activeβ-catenin 的表達并抑制Gsk-3β 的表達（P＜0.05）。Wnt 信號通路的靶基因cyclin D1、MMP7 和c-Myc在786-O-TIPE2 細(xì)胞中的表達也增加（P＜0.05）。然而，總β-catenin 水平在TIPE2 過度表達后沒有改變（P＞0.05），見圖4A、圖4B；相反，在shRNA 干擾（786-O-ShTIPE2）降低TIPE2 表達后，active-βcatenin、cyclin D1、MMP7 和c-Myc 的表達下降，而Gsk-3β 的表達增加（P＜0.05）；降低TIPE2 后，總βcatenin 水平?jīng)]有改變（P＞0.05），見圖4C、圖4D。

圖4 TIPE2 對β-catenin 和Wnt 信號通路的影響

圖4 TIPE2 對β-catenin 和Wnt 信號通路的影響（續(xù)）

3 討論

TIPE 家族是一個參與免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生的蛋白質(zhì)家族。TIPE 家族蛋白質(zhì)由一個致死結(jié)構(gòu)域組成，除此之外，與其他家族蛋白質(zhì)沒有顯著的序列相似性。TIPE2 是該家族的第3 個成員，由184 個氨基酸組成，是先天性免疫和適應(yīng)性免疫的新型調(diào)節(jié)因子，參與維持免疫穩(wěn)態(tài)[7-9]。已有研究證實TIPE2 在某些癌癥中出現(xiàn)異常表達，TIPE2 在不同腫瘤中所起的作用不同。TIPE2 可促進多種癌癥的進展，如肺癌、腎細(xì)胞癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌[13，17，18]；相反，TIPE2在食管癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌中起到腫瘤抑制作用[19-22]。這些不同的實驗結(jié)果說明TIPE2 在不同的癌癥或者癌癥的不同階段起著不同的作用，可能也與實驗者所選取的樣本數(shù)量和實驗條件有關(guān)?？傊琓IPE2 在不同癌癥中發(fā)揮不同作用的具體機制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)[13]，TIPE2 的mRNA 表達在腎癌組織中顯著增加，并且與腎癌的TNM 分期呈正相關(guān)，這表明TIPE2 高表達與ccRCC 的進展相關(guān)。然而，TIPE2 在ccRCC 發(fā)生發(fā)展中的作用和機制需要進一步研究。本研究通過分析UALCAN 在線數(shù)據(jù)庫資料，證實TIPE2 在ccRCC 中的mRNA 和蛋白水平的表達高于正常腎組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ccRCC中TIPE2 表達量最高，并且TIPE2 高表達預(yù)示ccRCC 患者預(yù)后不良。以上結(jié)果提示TIPE2 的表達水平可能作為ccRCC 臨床評估預(yù)后的指標(biāo)，TIPE2表達高的患者需要更密切關(guān)注疾病發(fā)展動態(tài)。

已有研究報道[18]，敲除TIPE2 可顯著降低人類肺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力和存活周期。本研究結(jié)果表明，TIPE2 過表達促進了ccRCC 786-O 細(xì)胞的增殖、集落形成以及侵襲和遷移能力。目前關(guān)于TIPE2在ccRCC 增殖和侵襲機制方面的研究甚少，已有研究表明TIPE2 可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路參與癌癥進展。MicroRNA-21 作為NF-κB 的直接靶點，可參與調(diào)節(jié)TIPE2 的功能，因此MicroRNA-21 能成為TIPE2 的上游調(diào)節(jié)因子[23]。在TIPE2 下游影響因素的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)TIPE2 明顯上調(diào)促凋亡蛋白如Bcl-2 相關(guān)X、Caspase-9、Caspase-3 的表達，并下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2 相關(guān)X1、Akt 的表達[24]。并且先前研究已經(jīng)證實TIPE2 可以調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin 途徑的β-catenin、c-Myc 和cyclinD1 的蛋白表達水平并參與疾病的發(fā)展[20，21，25]。TIPE2 還能通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR/NF-κB 信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[18]。本研究結(jié)果表明，TIPE2 可上調(diào)activeβ-catenin 和Wnt 靶基因的表達，如cyclinD1 和c-Myc。沉默TIPE2 后active-β-catenin 和cyclinD1、c-Myc 后表達減少，但TIPE2 只影響active-βcatenin 的表達，未影響total-β-catenin 的表達，說明TIPE2 參與影響β-catenin 的代謝調(diào)控而并未影響β-catenin 的轉(zhuǎn)錄水平。因此，TIPE2 可能通過激活Wnt 信號通路促進ccRCC 的增殖和侵襲能力，這一結(jié)果提示TIPE2 參與了ccRCC 的發(fā)生發(fā)展過程，其有望成為ccRCC 生物靶向治療的候選基因。

綜上所述，TIPE2 在ccRCC 中過度表達，并且與ccRCC 患者的不良預(yù)后相關(guān)；TIPE2 過表達能夠促進ccRCC 體外增殖和侵襲；TIPE2 是ccRCC 潛在的評估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，其可能作為癌基因促進ccRCC 的發(fā)展。然而，TIPE2 在ccRCC 中的具體作用機制還有待進一步研究。