不同干細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)血管形成的研究進(jìn)展*

劉 寧， 齊保玉， 孫傳睿， 金子開(kāi)， 王曉陽(yáng)， 孫 凱， 魏 戌

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102）

血管生成是包含多步驟且高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，對(duì)于生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)受損組織至關(guān)重要［1］。血管生成可能通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)生，包括芽生和非芽生［2］。血管生成由多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路控制，其發(fā)生與否取決于生物環(huán)境中促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡［3］。其中，血管新生的關(guān)鍵因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血管生成素（angiopoietin， Angpt）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor， FGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor， HGF）、血小板 源 性 生 長(zhǎng) 因 子（platelet-derived growth factor，PDGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）、低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor-β， TGF-β）、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor， PGF）、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體（kinase insert domain receptor， KDR）、具有免疫球蛋白樣和表皮生長(zhǎng)因子同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2 with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains， Tie2）、CD31、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein， IGFBP）、核因子 κB（nuclear factor-κB， NF-κB）等；抗血管生成因子主要包括血管抑制素1（vasohibin 1， VASH1）和血小板應(yīng)答蛋白 1（thrombospondin 1，THBS1）等。在再生醫(yī)學(xué)中，開(kāi)啟血管生成是非常關(guān)鍵的，我們前期已綜述了血管生成對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響，明確了血管生成在骨骼等高度血管化組織的修復(fù)和再生中的重要作用［4］。但目前對(duì)于血管生成調(diào)控的機(jī)制尚未闡明，研究表明細(xì)胞衍生的外泌體同參與血管生成的一系列介質(zhì)有關(guān)。

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體通過(guò)胞吐的方式釋放到胞外形成的，直徑范圍約為30～150 nm（平均約為100 nm），具有杯狀形態(tài)［5］。這些外泌體幾乎可由所有細(xì)胞類型分泌，如間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等［6］。同時(shí)，外泌體幾乎存在于所有的體液中，包括全血、血漿、腦脊液、尿液、精液、唾液、滑液、乳汁、眼淚等［7］。外泌體在細(xì)胞通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可幫助實(shí)現(xiàn)大量細(xì)胞功能，包括細(xì)胞間通訊、細(xì)胞增殖和分化、血管生成、應(yīng)激反應(yīng)和免疫信號(hào)傳導(dǎo)等。外泌體可以將生物信息傳遞給靶細(xì)胞，主要通過(guò)4種機(jī)制：（1）外泌體的膜蛋白可直接與靶細(xì)胞膜中的配體受體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路；（2）外泌體膜蛋白分裂成碎片，釋放與受體細(xì)胞受體結(jié)合的可溶性配體；（3）外泌體膜蛋白可與靶細(xì)胞膜直接融合；（4）通過(guò)吞噬作用等內(nèi)吞的過(guò)程將外泌體內(nèi)化［8］。所有外泌體都是膜性囊泡，具有供體細(xì)胞的典型特征，內(nèi)容物可以包括蛋白質(zhì)（四跨膜蛋白、膜聯(lián)蛋白、熱休克蛋白等）、脂質(zhì)（糖鞘脂、鞘磷脂、膽固醇）、遺傳物質(zhì)［DNA、tRNA、mRNA、微小RNA（microRNA， miRNA， miR）、sncRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）］和小分子代謝物（氨基酸、ATP、酰胺、糖）等。其中，成熟miRNA占外泌體總RNA的近41.7%，在外泌體發(fā)揮功能中起著重要作用［9］。這些特征使外泌體具備良好的生物學(xué)特性，包括生物相容性、穩(wěn)定性、低毒性、低免疫原性和分子貨物的高效交換等，使其成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程的主要候選者［10］。特別是在血管生成中的作用已在多種細(xì)胞類型中得到驗(yàn)證，因而在缺血性疾病中具有良好應(yīng)用前景。

在本文中，我們將總結(jié)不同干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在血管形成中的作用，同時(shí)重點(diǎn)關(guān)注外泌體作為一種天然納米顆粒用于將促血管生成因子輸送到內(nèi)皮細(xì)胞中，成為調(diào)節(jié)血管生成有力治療工具的潛力，從而為外泌體介導(dǎo)血管生成的研究提供參考資料。

1 外泌體的概述

外泌體是納米級(jí)細(xì)胞外微小囊泡，其分離純化一直是備受關(guān)注的問(wèn)題和難點(diǎn)，獲得高純度的外泌體對(duì)后續(xù)的研究至關(guān)重要。目前可通過(guò)各種方法從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得外泌體，當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的，也是目前被認(rèn)作金標(biāo)準(zhǔn)的，當(dāng)屬超速離心技術(shù)［11］。在外泌體的檢測(cè)和鑒定中，透射電子顯微鏡、納米粒子追蹤分析和Western blot是常用來(lái)評(píng)估的表征組合，為外泌體的存在提供有力證據(jù)［12］。此外，外泌體示蹤是探究外泌體生物分布、生理功能、遷移和靶向機(jī)制的重要手段，是深入研究外泌體機(jī)制的技術(shù)方法。親脂性熒光染料示蹤外泌體操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)儀器要求不高，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用［13］。外泌體為雙層脂膜，其穩(wěn)定性較好，避免了內(nèi)部生物分子受到體液中各種酶的影響，從而保持其相對(duì)的完整性和較好的生物活性。但其也可能與保存介質(zhì)、保存溫度和時(shí)間等因素有關(guān)。提取后一般置于磷酸鹽緩沖液中。目前應(yīng)用的保護(hù)技術(shù)主要有冷凍、冷凍干燥和噴霧干燥。建議提取后最好新鮮使用，或低溫短期保存，短時(shí)間內(nèi)可以存放于4 ℃或-20 ℃環(huán)境中，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存應(yīng)置于-80 ℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融［14］。

2 不同干細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)血管形成的作用

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）來(lái) 源 的 外 泌 體（MSCs-derived exosomes， MSCs-EXOs） MSCs具有良好的自我更新和多向分化能力，可以招募血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells， VECs），促進(jìn)VECs的增殖、遷移以及管形成，在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。MSCs可能通過(guò)旁分泌發(fā)揮組織再生和修復(fù)的功能，而MSCs-EXOs是旁分泌作用的主要物質(zhì)［15］。研究證實(shí)MSCs-EXOs具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化、抑制氧化應(yīng)激、增強(qiáng)血管生成等作用［16］。MSCs-EXOs尤其在新血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是缺血性疾病血管再生治療的理想候選者，可能成為細(xì)胞療法的替代品。研究表明，MSCs-EXOs的應(yīng)用可以在不同的疾病模型和內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells， ECs）中誘導(dǎo)新血管形成。然而，外泌體內(nèi)容物及其促血管生成的詳細(xì)機(jī)制仍不明確。miRNAs是ECs功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并且是特別重要的血管生成調(diào)節(jié)劑。有學(xué)者使用非接觸式共培養(yǎng)系統(tǒng)探索了MSCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）之間的miRNA 轉(zhuǎn)移，表明miR-424、miR-30c、miR-30b和miR-let-7f可轉(zhuǎn)移到HUVECs中發(fā)揮促血管再生作用［17］。還有研究通過(guò)敲減和過(guò)表達(dá)miR-21-5p，驗(yàn)證了外泌體miR-21-5p的生物活性，結(jié)果顯示MSCs-EXOs可通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-21-5p上調(diào)HUVECs中VEGF受體（VEGF receptor， VEGFR）并激活蛋白激酶 B（protein kinase B， PKB/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）來(lái)促進(jìn)糖尿病足大鼠缺血組織的修復(fù)和血管新生［18］。此外，與MSCs一起培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cells， CMECs）具有較高的增殖、遷移和血管生成能力，轉(zhuǎn)染MSCs中的miR-543使CMECs活力減弱，血管生成能力減弱；同時(shí)與單純轉(zhuǎn)染IV型膠原蛋白α1鏈（collagen type IV α1 chain，COL4A1）基因的CMECs相比，轉(zhuǎn)染COL4A1和miR-543后的CMECs增殖、遷移和血管生成較低，表明MSCs-EXOs可通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-543下調(diào)CMECs中COL4A1表達(dá)，促進(jìn)CMECs增殖、遷移和管生成［19］?？傊琈SCs-EXOs在血管生成中具有重要作用，主要依賴miRNA發(fā)揮功能。

MSCs屬成體干細(xì)胞，其來(lái)源組織豐富，如：骨髓、脂肪、臍帶組織、胎盤(pán)組織等，而這些細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)血管形成也有積極影響［20］。

2.1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells， BMSCs）來(lái)源的外泌體（BMSCs-EXOs） BMSCs是最早分離獲得的MSCs，也是目前干細(xì)胞治療中研究和應(yīng)用最多的MSCs類型，其安全性和有效性已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。因具有強(qiáng)大的旁分泌效應(yīng)、體外分離培養(yǎng)相對(duì)容易、增殖速率快等優(yōu)點(diǎn)，成為提取外泌體理想的種子細(xì)胞［21］。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了BMSCs-EXOs在促進(jìn)疾病模型血管生成和增強(qiáng)ECs增殖、遷移方面的重要作用［22-24］。例如，Liu等［25］發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs可顯著促進(jìn)HUVECs增殖、遷移和管形成，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了BMSCs-EXOs局部注射后第28天顯著增加脊髓損傷大鼠的血管總量，同時(shí)增強(qiáng)VEGF的表達(dá)水平。有學(xué)者對(duì)BMSCs-EXOs的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。有研究表明BMSCs-Exos可促進(jìn)大鼠肩袖重建后肌腱愈合，主要通過(guò)VEGF信號(hào)通路促進(jìn)血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)［26］。另有研究指出，BMSCs-EXOs可促進(jìn)股骨不愈合大鼠的恢復(fù)，其中骨形成和血管生成發(fā)揮關(guān)鍵作用，這種促進(jìn)作用可能歸因于骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2， BMP-2）/Smad1/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的激活［27］。另有研究報(bào)道，BMSCs-EXOs可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)某些血管生成相關(guān)蛋白，激活內(nèi)皮細(xì)胞中的相關(guān)因子和信號(hào)通路發(fā)揮促血管再生的作用。Anderson等［28］對(duì)BMSCs-EXOs進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中存在多種具有促進(jìn)血管生成作用的旁分泌效應(yīng)因子，如PDGF、FGF、EGF，以及NF-κB蛋白，而NF-κB被認(rèn)為是外泌體誘導(dǎo)ECs生成的關(guān)鍵介質(zhì)。此外，有研究顯示BMSCs-EXOs可調(diào)控MSCs中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer， EMMPRIN）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和VEGF等相關(guān)血管生成蛋白的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）/Akt通路，促進(jìn)ECs的遷移和血管生成［29］。從現(xiàn)有研究來(lái)看，BMSCs-EXOs主要通過(guò)向ECs傳遞miRNA，對(duì)其生物活性產(chǎn)生影響。研究表明，BMSCs-EXOs在體外促進(jìn)成肌細(xì)胞肌形成和HUVECs血管生成，并在肌肉損傷的大鼠模型中促進(jìn)肌肉再生和血管生成，這部分是由miR-494等miRNA介導(dǎo)［30］。還有證據(jù)表明，BMSCs-EXOs通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-29b-3p靶向腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvessel endothelial cells，BMECs）中10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN），激活A(yù)kt信號(hào)通路，并促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠的血管生成，進(jìn)而減輕缺血性腦損傷［31］。另外，來(lái)自BMSCs-EXOs產(chǎn)生的lncRNA也能增強(qiáng)血管生成。有學(xué)者觀察了BMSCs-EXOs是否通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)lncRNA-H19 （lnc-H19）來(lái)促進(jìn)成骨和血管生成，首先使用lncRNA PCR陣列篩選，在BMSCs-EXOs中鑒定出一種骨特異性的lnc-H19，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析，找出了可以與lnc-H19結(jié)合的miR-106a，螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-106a與靶基因Angpt1直接結(jié)合，最終表明外泌體通過(guò)lnc-H19調(diào)節(jié)HUVECs中miR-106a的表達(dá)，并調(diào)節(jié)血管生成因子Angpt1的表達(dá)，從而激活Tie2-NO信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)成骨和血管生成［32］。Han等［33］在BMSCs-EXOs中檢測(cè)了一種新的生物活性分子lncRNA KLF3-AS1，這些外泌體被HUVECs吸收，通過(guò)下調(diào)miR-383和提高其靶標(biāo)VEGFA表達(dá)來(lái)促進(jìn)增殖、遷移和血管形成，并刺激糖尿病大鼠損傷皮膚的愈合。上述研究表明，BMSCs-EXOs可調(diào)控相關(guān)蛋白促進(jìn)血管形成，可能與外泌體分泌的促血管生成因子、miRNA和lncRNA有關(guān)。

2.1.2 脂 肪 干 細(xì) 胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）來(lái)源的外泌體（ADSCs-EXOs） ADSCs是人體儲(chǔ)量豐富的MSCs，因具有較強(qiáng)的增殖分化能力、免疫調(diào)節(jié)作用以及獲取便利、成本低等優(yōu)勢(shì)，常用于組織再生與修復(fù)［34］。脂肪組織中MSCs的濃度明顯高于骨髓（1%對(duì)0.01%）和其他來(lái)源，與骨髓相比，從脂肪組織中獲取MSCs的侵入性較小，并且沒(méi)有倫理限制，還具有免疫調(diào)節(jié)特性［35］。ADSCs-EXOs可促進(jìn)ECs的遷移和增殖，在新血管的形成中起關(guān)鍵作用。研究表明，ADSCs-EXOs可在不同的疾病模型和ECs中促進(jìn)血管再生［36-37］。Lin等［38］發(fā)現(xiàn)ADSCs-EXOs能夠促進(jìn)急性缺血再灌注腎臟損傷大鼠中CD31、vWF等血管生成標(biāo)志因子的表達(dá)，從而增加腎臟中的血管生成和血流。還有研究者報(bào)道，ADSCs-EXOs可以通過(guò)增加VEGF表達(dá)，促進(jìn)損傷小鼠皮膚傷口愈合、加速上皮再形成、減少疤痕寬度以及增強(qiáng)血管生成和膠原合成［39］。然而，其促血管生成的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明。Pu等［40］將標(biāo)記的ADSCs-EXOs注射到皮瓣內(nèi)，觀察到ADSCs-Exo中的IL-6促進(jìn)了皮瓣損傷小鼠的血管生成和恢復(fù)，進(jìn)一步研究表明信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3磷酸化參與IL-6表達(dá)和血管生成。有研究通過(guò)RNA測(cè)序檢測(cè)了ADSCs-EXOs中富集的miRNA，同時(shí)借助生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了排名前30位的外泌體miRNA的1 119個(gè)靶點(diǎn)，并最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ADSCs-EXOs中miR-423-5p可以通過(guò)下調(diào)HUVECs中Sufu （supressor of fused homolog）的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)遷移和血管形成能力［41］。還有研究表明ADSCs-EXOs中的幾種miRNA有助于后肢缺血小鼠的血管生成和血液灌注的改善，而使用外泌體抑制劑則會(huì)損害ADSCs介導(dǎo)的血管生成和血液灌注改善。RNA分析顯示，ADSCs-EXOs中miR-21、miR-27b、miR-322和let-7i高表達(dá)，外泌體抑制劑處理可降低ADSCs-EXOs中miR-21、miR-27b、miR-322和let-7i的表達(dá)；此外，抑制劑處理的ADSCs-EXOs誘導(dǎo)miR-21靶標(biāo)Smad7和PTEN及miR-322靶標(biāo)Cul2在ECs中的表達(dá)，從而抑制血管生成［42］。Pi等［43］采用皮膚損傷小鼠評(píng)價(jià)了miR-125a-3p對(duì)傷口愈合的影響，結(jié)果顯示miR-125a-3p能夠促進(jìn)小鼠創(chuàng)面修復(fù)，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-125a-3p和PTEN的相互作用，表明ADSCs-EXOs通過(guò)miR-125a-3p負(fù)調(diào)控HUVECs中PTEN表達(dá)并激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）和 Akt信號(hào)通路，促進(jìn)HUVECs的活力、遷移和管生成，促進(jìn)傷口愈合。其他研究表明ADSCs-EXOs可以被ECs吸收并在體外和體內(nèi)顯著促進(jìn)血管生成；進(jìn)一步的研究顯示，miR-125a在ADSCs-EXOs中富集，并通過(guò)靶向抑制血管生成抑制劑δ樣蛋白4（Delta-like protein 4， DLL4）的表達(dá)調(diào)節(jié)ECs血管生成［44］。還有證據(jù)表明，ADSCs-EXOs通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miR-31靶向人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cells， HMVECs）中缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子1（factor inhibiting HIF-1， FIH1）并因此觸發(fā)HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)缺血小鼠后肢和心臟的血管生成［45］。還有研究者報(bào)道，從外泌體釋放的miR-132和miR-146a能夠促進(jìn)血管生成基因Angpt1和KDR的表達(dá)，同時(shí)使抗血管生成基因VASH1和THBS1的表達(dá)減弱，進(jìn)而增加HUVECs的血管新生［46］?？傊?，ADSCs-EXOs富含血管生成相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子，并可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)不同種類功能酶或miRNA而激活ECs中的多種相關(guān)因子和信號(hào)通路，誘導(dǎo)ECs增殖，從而促進(jìn)新血管的形成。

2.1.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hucMSCs）來(lái) 源 的 外 泌 體（hucMSCs-EXOs） 與其他 MSCs相比，hucMSCs具有成本低、侵襲性低、高自我更新能力、易分離、細(xì)胞含量高、免疫原性低、基因轉(zhuǎn)染效率高、涉及的倫理問(wèn)題較少等特點(diǎn)，引起了組織修復(fù)科學(xué)家的興趣［47］。hucMSCs-EXOs具有血管生成潛力，已成為促進(jìn)血管再生細(xì)胞治療的工具。多項(xiàng)研究表明，hucMSCs-EXOs能夠促進(jìn)多種疾病模型和HUVECs的血管形成［48-50］。hucMSCs-EXOs攜帶的蛋白質(zhì)（酶、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子）或miRNA可能與促進(jìn)血管生成有關(guān)。Liu等［51］報(bào)道，hucMSCs-EXOs促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和成管能力，其中hucMSCs-EXOs含有的Angpt2通過(guò)外泌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，可增強(qiáng)皮膚燒傷大鼠的創(chuàng)面區(qū)域和HUVECs中Angpt2蛋白的表達(dá)，加速皮膚傷口愈合和血管生成。還有研究分析了hucMSCs-EXOs中顯著過(guò)表達(dá)的miRNA，miR-1246表現(xiàn)出高表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)了miR-1246的靶向mRNA，證實(shí)了hucMSCs-EXOs通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-1246靶向 HUVECs中絲氨酸蛋白酶 23（serine protease 23，PRSS23）激活 Snail/α-SMA 通路，促進(jìn) VEGFA 和CD31表達(dá)，并增強(qiáng)心衰小鼠心臟的血管生成［52］。因此，hucMSCs-EXOs主要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)其內(nèi)源性的miRNA和血管生成相關(guān)因子進(jìn)入ECs，從而促進(jìn)血管形成。

2.1.4 胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞（placental mesenchymal stem cells， PMSCs）來(lái)源的外泌體（PMSCs-EXOs）胎盤(pán)組織獲得不涉及侵入性程序，在倫理上使其成為更有利的來(lái)源，且因其豐富、易于獲得而作為MSCs的替代來(lái)源而受到廣泛關(guān)注。PMSCs主要存在于胎盤(pán)的血管生態(tài)位中，對(duì)血管生成具有更高的效力［53］。PMSCs因其增殖、遷移、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性而在臨床上很有前景［54］。最近研究表明PMSCs-EXOs已成為促進(jìn)血管生成的有力工具。據(jù)報(bào)道，PMSCs-EXOs的應(yīng)用能夠促進(jìn)脊髓損傷小鼠和HUVECs的血管生成［55］。同時(shí)，PMSCs-EXOs存在多種具有促進(jìn)血管生成的旁分泌效應(yīng)因子，其中HGF、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6等細(xì)胞因子可以刺激HUVECs中血管生成標(biāo)志物Tie2和Angpt2表達(dá)，并促進(jìn)耳廓缺血性損傷小鼠的血管新生［56］。目前對(duì)于PMSCs-EXOs的研究相對(duì)較少，其促進(jìn)血管形成的有效機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

2.2 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）來(lái)源的外泌體（iPSCs-EXOs） iPSCs可從體內(nèi)的任何組織類型中產(chǎn)生，可以在培養(yǎng)中傳代超過(guò)40代。它具有再生特性并能夠分化成體內(nèi)的任何細(xì)胞譜系，與胚胎干細(xì)胞的特性相似，但比胚胎干細(xì)胞更容易收獲，并且不涉及倫理爭(zhēng)議［57］。因此，iPSCs在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景廣闊。研究表明，iPSCs和iPSCs衍生細(xì)胞除了具有轉(zhuǎn)分化能力外，還主要通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮治療作用，外泌體已成為iPSCs通過(guò)傳遞生物活性成分修復(fù)受損細(xì)胞的重要旁分泌因子［58］，關(guān)于iPSCs-EXOs在各種疾病動(dòng)物模型和HUVECs中促血管再生的報(bào)告正在增加。有研究報(bào)道，iPSCs-EXOs可促進(jìn)HUVECs中血管生成相關(guān)基因VEGF、VEGFA、VEGFB、KDR、HIF-1α、TGF-β1、PGF、bFGF、Angpt和bFGF受體（bFGF recepter，bFGFR）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HUVECs遷移、增殖和管形成，同時(shí)可增加后肢缺血小鼠的微血管密度［59］。Liu等［60］發(fā)現(xiàn)，iPSCs-EXOs通過(guò)激活HUVECs中PI3K/Akt通路促進(jìn)管形成，并增加股骨頭壞死大鼠血管數(shù)量，防止骨丟失。同樣，目前對(duì)于iPSCs-EXOs的研究仍較少，相關(guān)研究有待深入。

2.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）來(lái)源的外泌體（EPCs-EXOs） EPCs具有自我更新、游走、高增殖和定向分化特性，能參與損傷內(nèi)皮修復(fù)和促進(jìn)血管新生［61］。近年來(lái)有研究認(rèn)為EPCs促進(jìn)內(nèi)皮再生的作用不僅是通過(guò)直接分化為成熟ECs來(lái)促進(jìn)，而且通過(guò)旁分泌機(jī)制刺激原本殘留ECs的增殖和遷移，從而修復(fù)受損的血管［62］。在EPCs分泌的所有物質(zhì)中，對(duì)于外泌體的研究較多。外泌體含有大量來(lái)自其原始細(xì)胞的成分，是旁分泌的重要途徑，在細(xì)胞間通訊中表現(xiàn)出功能性生物活性。目前，EPCs-EXOs促進(jìn)血管新生的作用在各種疾病模型和ECs中得到了廣泛研究。例如，有研究表明EPCs來(lái)源的外泌體能夠增加糖尿病皮膚損傷大鼠和HMVECs中相關(guān)血管生成因子表達(dá)［63-64］。然而，EPCs修復(fù)血管的機(jī)制仍不清楚。據(jù)報(bào)道，EPCs-EXOs分泌的miRNA在這個(gè)過(guò)程中起重要作用。Xu等［65］通過(guò)高通量測(cè)序顯示miR-221-3p在EPCs-EXOs中高表達(dá)，EPCs-EXOs給藥顯著增強(qiáng)了糖尿病小鼠的皮膚傷口愈合；免疫組織化學(xué)分析表明，EPCs-EXOs增加了VEGF、CD31等血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)，加快傷口愈合。同時(shí)有學(xué)者使用HUVECs和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型研究了miR-221-3p的潛在血管生成作用，表明miR-221-3p促進(jìn)了HUVEC的生存能力、遷移和管形成，同時(shí)促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（homeodomain interacting protein kinase 2， HIPK2）是 miR-221-3p的直接靶標(biāo)，皮下注射miR-221-3p到糖尿病小鼠體內(nèi)可促進(jìn)傷口愈合并抑制HIPK2在傷口邊緣組織中的表達(dá)［66］。Wang等［67］觀察了EPCs-EXOs對(duì)糖尿病中風(fēng)小鼠的影響，并測(cè)試了EPCs-EXOs是否富集miR-126，顯示EPCs-EXOs分泌的miR126可升高糖尿病中風(fēng)小鼠中VEGFR2表達(dá)，減輕急性損傷和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，達(dá)到治療缺血性中風(fēng)的目的。同樣有研究觀察了EPCs-EXOs對(duì)急性肺損傷的影響，顯示EPCs-EXOs的給藥改善了脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷并恢復(fù)了體內(nèi)肺完整性；同時(shí)增強(qiáng)了HUVECs的增殖、遷移和管形成，此外，研究顯示miR-126在EPCs-Exos中富集，并且可以轉(zhuǎn)移到HUVECs上，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)miR-126靶向sprouty相關(guān)含EVH1結(jié)構(gòu)域蛋白1（sprouty-related EVH1 domain-containing protein 1，SPRED1），導(dǎo)致SPRED1的下調(diào)，并促進(jìn)ERK信號(hào)通路改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而加快肺損傷修復(fù)［68］。Hu等［69］發(fā)現(xiàn)，EPCs-EXOs給藥在大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后的早期階段增強(qiáng)了再內(nèi)皮化，加快大鼠血管損傷的恢復(fù)；外源EPCs-EXOs攝取增強(qiáng)了HUVECs的增殖速率、遷移和成管能力，對(duì)miRNA-mRNA相互作用的綜合分析表明，miR-21-5p在EPCs-EXOs中高度富集，并特異性抑制THBS1在受體ECs中的表達(dá)。Ke等［70］將miR-218-5p和miR-363-3p注射入心肌梗死大鼠，表明其可能通過(guò)調(diào)控p53/JMY通路促進(jìn)血管生成，恢復(fù)大鼠的心肌組織完整性。還有學(xué)者以糖尿病皮膚損傷大鼠和HMVECs為模型，研究了外泌體在糖尿病傷口修復(fù)中的作用，結(jié)果顯示EPCs-EXOs通過(guò)旁分泌將miR-21遞送至HMVECs，激活ERK1/2信號(hào)通路來(lái)刺激ECs的血管生成活性，并促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚傷口的修復(fù)和新生［71］。如前所述，EPCs-EXOs促進(jìn)血管形成的研究相對(duì)較多，機(jī)制多與miRNA有關(guān)。

3 小結(jié)與展望

外泌體作為細(xì)胞外囊泡之一，通過(guò)轉(zhuǎn)移其遺傳內(nèi)容在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為一種新型無(wú)細(xì)胞治療策略已引起研究者的廣泛關(guān)注。外泌體通常具有廣泛的功能性mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，可反映其來(lái)源和細(xì)胞的生理狀態(tài)，因此不同來(lái)源外泌體具有不同的特點(diǎn)和功能，探索不同來(lái)源外泌體的特點(diǎn)和功能將有助于不同疾病的研究。諸多證據(jù)證實(shí)，不同來(lái)源的外泌體在不同缺血疾病模型中可修復(fù)血管損傷、促進(jìn)血管新生，從而延緩血管生成障礙疾病的病理進(jìn)程，同時(shí)在疾病病發(fā)及預(yù)后方面也發(fā)揮重要作用，具有很好的臨床應(yīng)用前景。其中隨著外泌體外源性miRNA在血管再生研究中的不斷深入，其所產(chǎn)生的治療價(jià)值也更顯著，受到社會(huì)各界的密切關(guān)注。但目前對(duì)于外泌體在血管生成中的有效機(jī)制及具體成分的研究尚處于起步階段，仍需更深層次探索。關(guān)于其給藥劑量、安全性和作用持續(xù)時(shí)間等是目前需要重點(diǎn)關(guān)注并解決的問(wèn)題，同時(shí)哪種細(xì)胞類型、組織及體液衍生的外泌體是有效的調(diào)節(jié)劑也有待確定。此外，外泌體獲取的產(chǎn)量較少且純度較低，如何優(yōu)化分離提取方案及純化方法來(lái)增加外泌體的質(zhì)量和產(chǎn)量，以及如何通過(guò)不同的預(yù)處理方式增強(qiáng)其治療的功效，仍有待進(jìn)一步的研究，才能為更好地應(yīng)用于臨床提供基礎(chǔ)支撐。另外，外泌體在作為診斷標(biāo)志物方面具有很好的價(jià)值，但目前在血管相關(guān)疾病領(lǐng)域的研究較少，需要更多的臨床前和臨床研究來(lái)探究循環(huán)外泌體作為相關(guān)疾病的診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛力。除此之外，關(guān)于外泌體促進(jìn)血管新生的研究多集中在動(dòng)物、細(xì)胞或基因水平，其應(yīng)用于人體后是否仍有同樣的作用，尚不得而知。因此，多中心、大規(guī)模和隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)可能是基礎(chǔ)和必須的，需要在臨床試驗(yàn)中深入的研究其安全性、有效性，并解決其潛在的副作用，從而更好地實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化?？傮w而言，各種干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在血管生成中的潛力是非常有前景的，進(jìn)一步明確外泌體在血管生成中的功能與機(jī)制，并推進(jìn)相關(guān)臨床研究，將有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)血管生成障礙有關(guān)疾病的有效治療策略，從而使外泌體的治療具備理論價(jià)值與實(shí)踐意義。