白術(shù)內(nèi)酯III通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路減輕潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道損傷*

魯慧東， 李艷梅

（1赤峰市醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）作為一種發(fā)生于結(jié)腸的慢性非特異性炎癥性疾病，發(fā)病率逐年升高，以腹瀉、血便及體重減輕等為主要臨床癥狀，腸道損傷是其病理基礎(chǔ)，其易反復(fù)發(fā)作且難以治愈，嚴(yán)重困擾著患者的正常生活和工作［1-2］。目前，UC病因尚不明確，既往研究認(rèn)為其可能受遺傳、環(huán)境、免疫及腸道菌群等多因素影響，且若UC治療不及時，可能增加腫瘤形成的風(fēng)險［3-4］。因此，積極探究UC發(fā)病機制并開發(fā)有效治療藥物具有實際意義。

白術(shù)內(nèi)酯 III（atractylenolide III， AT III）是白術(shù)根提取物中的主要生物活性化合物之一，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激等多種藥理作用［5-6］。已有研究顯示白術(shù)內(nèi)酯III可通過激活腺苷酸激活蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α信號通路緩解UC中線粒體功能障礙［7］。此外，多項研究［8-9］表明，Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）信號通路參與UC發(fā)生及病變緩解。另有研究證實白術(shù)內(nèi)酯III可改善小膠質(zhì)細(xì)胞JAK2/STAT3/發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1， Drp1）依賴性線粒體分裂相關(guān)的腦缺血性損傷和神經(jīng)炎癥［10］。然而，白術(shù)內(nèi)酯III是否可通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路緩解UC模型小鼠腸道損傷尚無相關(guān)報道?；诖?，本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfact sodium，DSS）誘導(dǎo)UC小鼠模型，探究白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠腸道損傷的影響及JAK2/STAT3信號通路在此過程中的作用。

材料和方法

1 動物

48只6周齡無特定病原體級健康雄性C57BL/6小鼠，體重18～22 g，購自北京北方艾特生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0005。在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下飼養(yǎng)，溫度（22±1）℃，濕度45%～55%，光/暗循環(huán)12 h∶12 h，自由獲取鼠糧和無菌水。所有動物都按照《實驗室動物護理和使用指南》進行護理，同時本研究獲得本院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑

DSS（純度99%， MP Biomedicals）；白術(shù)內(nèi)酯III（純度99.91%， MCE）；香豆霉素A1（一種JAK2激活劑，純度≥95%，上海翌圣生物科技股份有限公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、過碘酸雪夫（Periodic Acid-Schiff，PAS）染色試劑盒、DAB試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；小鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔源I抗閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體及II抗辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（Abcam）。

3 主要方法

3.1 分組、造模與給藥 48只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按照隨機數(shù)字表法隨機分為正常（normal）組、模型（model）組、白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量（AT III-L、AT III-M、AT III-H）組和白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑（AT III+CA1）組，每組各8只。除正常組小鼠自由飲用蒸餾水外，其余各組小鼠自由飲用2.5%（2.5 g/100 mL）DSS水溶液連續(xù)7 d構(gòu)建UC模型［11］，隨后將DSS水溶液換成蒸餾水。同時于造模第1天開始，參照文獻［7，12-13］及預(yù)實驗結(jié)果（白術(shù)內(nèi)酯III使用劑量為5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg時，小鼠均無不良反應(yīng)），白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組分別尾靜脈注射 5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg白術(shù)內(nèi)酯III，每天1次，連續(xù)7 d；白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組同一時間尾靜脈注射15 mg/kg 白術(shù)內(nèi)酯III和1 mg/kg香豆霉素A1；正常組和模型組同一時間給予等量蒸餾水。

3.2 一般情況觀察 實驗期間，每天觀察并詳細(xì)記錄小鼠的活動、毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、糞便性狀和隱血/便血情況以及體重變化等。并根據(jù)體重變化、糞便性狀和隱血/便血情況，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1. DAI scoring scale

3.3 樣品采集 末次給藥后，禁食24 h，麻醉后脫頸處死小鼠，分離回盲部到肛門的結(jié)腸組織，測量結(jié)腸長度，并將結(jié)腸組織分成兩份，一份置于4%多聚甲醛中固定；另一份置于液氮中速凍過夜，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 HE染色檢測結(jié)腸組織病理學(xué)變化 于4%多聚甲醛中固定24 h后，將結(jié)腸組織石蠟包埋，制備成常規(guī)石蠟切片（4 μm厚），HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化。每張切片隨機選取5個視野（高倍鏡，×400），通過雙盲法進行組織病理學(xué)評分（評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻［11］所述方法），取平均值作為最終結(jié)果。

3.5 PAS染色檢測結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞 4 μm厚的結(jié)腸組織石蠟切片進行常規(guī)脫蠟和水化，加入高碘酸溶液室溫孵育1 h，蒸餾水洗滌后加入Schiff溶液37 ℃孵育20 min，流水沖洗后蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化5 s，返藍(lán)后脫水、透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

3.6 免疫組化法檢測結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá) 4 μm厚的結(jié)腸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，于檸檬酸緩沖液中加熱10 min以進行抗原熱修復(fù)，室溫下用山羊血清封閉15 min后用I抗（ZO-1、occludin抗體）在4 ℃下孵育過夜，使用HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，返藍(lán)后脫水、透明、封片。每張切片隨機選取5個視野（高倍鏡，×400）拍照，采用Image J軟件半定量分析蛋白表達(dá)，蛋白表達(dá)量以陽性蛋白所占面積表示。

3.7 ELISA法檢測結(jié)腸組織中炎癥因子水平 取結(jié)腸組織，制備勻漿液，BCA法對蛋白濃度進行定量，按照ELISA試劑盒說明書分別測定結(jié)腸組織勻漿液中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平。

3.8 Western blot法檢測結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 添加裂解液于冰上充分裂解結(jié)腸組織，離心后吸取上清液，BCA法對蛋白濃度進行定量。各樣品取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后加入Ⅰ抗（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH抗體）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入Ⅱ抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG）室溫孵育1.5 h，PBS洗滌后化學(xué)發(fā)光法顯色。ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量（GAPDH為內(nèi)參蛋白）。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 8軟件分析實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠一般情況的影響

正常組小鼠活動正常，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好，糞便成形，無隱血/便血，體重呈上升趨勢；模型組小鼠活動逐漸減少，毛發(fā)失去光澤，精神萎靡，部分糞便呈稀水樣，糞便隱血陽性或肉眼可見便血，體重明顯下降；白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠上述表現(xiàn)均存在不同程度的改善，且白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組改善最為明顯；白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠上述表現(xiàn)介于白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組和模型組之間。

2 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠體重變化和DAI的影響

實驗結(jié)束時，與正常組相比，模型組小鼠體重顯著降低，DAI評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠體重顯著升高，DAI評分顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠體重顯著降低，DAI評分顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

Figure 1. Effects of atractylenolide III on body weight change （A） and DAI（B） in UC mice. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AT III-H group.圖1 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠體重變化和DAI的影響

3 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸長度和組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整且未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠腸壁結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，腺體變形甚至消失，杯狀細(xì)胞丟失，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠上述病理損傷逐漸改善，其中白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組改善最為明顯；白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠上述病理損傷較白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組加重，見圖2。與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短，組織病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠結(jié)腸長度顯著增加，組織病理學(xué)評分顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短，組織病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.05）；見表2。

表2 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸長度和組織病理學(xué)變化的影響Table 2. Effects of atractylenolide III on colon length and histopathological changes in UC mice （Mean±SD. n=8）

Figure 2. Effects of atractylenolide III on histopathological changes of colon in UC mice. The scale bar=200 μm.圖2 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響

4 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的影響

杯狀細(xì)胞位于小鼠結(jié)腸黏膜上皮和腸腺上皮之間，呈酒杯狀，主要作用是分泌黏液，PAS染色可將杯狀細(xì)胞中的黏液素染成紫紅色。與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，顏色變淺；而與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，顏色加深，且白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組變化最為明顯；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，顏色變淺。見圖3。

Figure 3. Effects of atractylenolide III on goblet cells in colon tissue of UC mice. The scale bar=50 μm.圖3 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的影響

5 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，ZO-1和occludin蛋白陽性在結(jié)腸組織中呈棕黃色染色，主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞，位于細(xì)胞質(zhì)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1和occludin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1和occludin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1和occludin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

6 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和IL-6水平顯著升高，IL-4和IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和IL-6水平顯著降低，IL-4和IL-10水平顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6水平顯著升高，IL-4和IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響Table 3. Effects of atractylenolide III on the levels of inflammatory factors in colon tissue of UC mice （ng/g. Mean±SD. n=8）

7 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，白術(shù)內(nèi)酯III（低、中、高）劑量組小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；與白術(shù)內(nèi)酯III高劑量組相比，白術(shù)內(nèi)酯III+JAK2激活劑組小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見圖5。

討 論

雖然目前用于UC臨床治療的藥物種類繁多，但現(xiàn)有的治療手段仍無法完全治愈，多數(shù)患者須終身服藥，同時也伴有一定副作用，給患者帶來沉重的經(jīng)濟和心理負(fù)擔(dān)，UC已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一［14］。因此，本研究通過構(gòu)建UC動物模型，旨在篩選一種治療UC的潛在藥物。

Figure 4. Effects of atractylenolide III on the expression of tight junction proteins ZO-1 and occludin in colon tissue of UC mice. The scale bar=200 μm. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AT III-H group.圖4 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)的影響

目前，國內(nèi)外對UC動物模型的選擇尚不統(tǒng)一，其中大鼠和小鼠是最常用的動物，且造模的方法也各有差異。為保證實驗的穩(wěn)定性和可靠性，本研究采用自由飲用2.5% DSS水溶液連續(xù)7 d構(gòu)建C57BL/6小鼠UC模型，此方法簡便廉價、維持性好、易于復(fù)制、成功率高、便于直觀觀察造模成功與否，且DSS誘導(dǎo)的UC類似于人類UC發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)［15］。本研究成功構(gòu)建了UC小鼠模型，具體表現(xiàn)為精神萎靡，糞便呈稀水樣，糞便出現(xiàn)隱血或便血，體重下降等現(xiàn)象，且DAI評分升高，結(jié)腸長度縮短，結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯病理損傷，與文獻報道［15］一致。而本研究采用白術(shù)內(nèi)酯III治療UC小鼠后，UC小鼠的上述病變表現(xiàn)均存在不同程度改善，表明白術(shù)內(nèi)酯III可能對UC小鼠具有較好治療效果。

據(jù)大量文獻報道，腸屏障損傷與UC的發(fā)生和進展關(guān)系密切，而緊密連接結(jié)構(gòu)作為腸屏障的最重要組成部分，對于維持腸屏障的正常功能至關(guān)重要。腸屏障緊密連接結(jié)構(gòu)破壞后，腸黏膜通透性增加，促使各種病原微生物和大分子物質(zhì)進入機體，引起一系列炎癥反應(yīng)，而當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生后，杯狀細(xì)胞受損，從而減少腸道上皮細(xì)胞表面的黏液分泌，進一步增加了上皮細(xì)胞與各種病原微生物的接觸［16］。ZO-1、occludin是腸屏障緊密連接結(jié)構(gòu)中的重要蛋白，其表達(dá)和分布可用來判斷結(jié)腸的腸屏障功能［17］。抗炎因子IL-4、IL-10和促炎因子IL-1β、IL-6在UC炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色［9，18］。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯III可改善UC引起的小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、occludin、IL-4、IL-10水平下降，IL-1β、IL-6水平上升以及杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。表明白術(shù)內(nèi)酯III可調(diào)節(jié)腸屏障緊密連接結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，緩解UC小鼠腸道損傷。Han等［7］研究也證實了白術(shù)內(nèi)酯III可減輕UC癥狀，抑制炎癥和氧化應(yīng)激，并恢復(fù)UC小鼠結(jié)腸上皮屏障的破壞，本研究結(jié)果與其一致。

Figure 5. Effects of atractylenolide III on the expression of JAK2， p-JAK2， STAT3 and p-STAT3 proteins in colon tissues of UC mice. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs normal group； #P＜0.05 vs model group； △P＜0.05 vs AT III-H group.圖5 白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

白術(shù)內(nèi)酯III的抗炎作用雖已在多項研究中得到證實，但是，其減輕炎癥反應(yīng)并緩解腸道損傷的機制仍很大程度上未知。因此，本研究探索了與機體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的通路—JAK2/STAT3信號通路在白術(shù)內(nèi)酯III緩解UC小鼠腸道損傷中的作用。JAK2是非受體型酪氨酸蛋白酶家族成員之一，其在細(xì)胞因子和生長因子刺激作用下激活，活化后的JAK2進一步激活下游STAT3（一種脫核苷酸結(jié)合蛋白），各種靶蛋白的酪氨酸殘基促使膜外刺激信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)后引起JAK2、STAT3磷酸化，p-STAT3轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯［19］。本研究Western blot結(jié)果顯示，UC小鼠結(jié)腸組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高，提示UC誘導(dǎo)JAK2/STAT3信號通路激活；而白術(shù)內(nèi)酯III治療后，UC小鼠結(jié)腸組織中JAK2/STAT3信號通路激活受到抑制，表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ緩解UC小鼠腸道損傷，可能與抑制JAK2/STAT3信號通路激活有關(guān)。香豆霉素A1是一種JAK2信號激活劑，可激活JAK2/STAT3信號通路［20］。本研究在白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ治療基礎(chǔ)上給予香豆霉素A1，結(jié)果顯示香豆霉素A1可激活結(jié)腸組織中JAK2/STAT3信號通路，同時減弱白術(shù)內(nèi)酯III對UC小鼠腸道損傷的緩解作用，這進一步證實了白術(shù)內(nèi)酯III可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活緩解UC小鼠腸道損傷。既往文獻也報道，抑制IL-6/JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)可恢復(fù)結(jié)腸組織中Treg和Th17細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，從而減輕DSS誘導(dǎo)的UC［21］。

綜上所述，白術(shù)內(nèi)酯III能夠抑制JAK2/STAT3信號通路激活，減輕局部炎癥反應(yīng)，緩解UC小鼠腸道損傷。本研究為UC的防治提供了新的實驗依據(jù)。