中藥半枝蓮質(zhì)量評價(jià)的研究進(jìn)展

徐 碩，徐文峰，鄺詠梅，金鵬飛

北京醫(yī)院藥學(xué)部，國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京市藥物臨床風(fēng)險(xiǎn)與個(gè)體化應(yīng)用評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京醫(yī)院)，北京 100730

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草，具有清熱解毒、化瘀利尿的功效，可用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸以及蛇蟲咬傷[1]?！吨腥A人民共和國藥典》(2020年版)(以下簡稱《中國藥典》)中通過對半枝蓮中總黃酮和野黃芩苷含量進(jìn)行測定，規(guī)定含總黃酮以野黃芩苷計(jì)不得少于1.50%，含野黃芩苷不得少于0.20%[1]，從而評價(jià)半枝蓮質(zhì)量。研究表明，半枝蓮中的主要活性成分包括黃酮類、二萜類、生物堿類、甾體、多糖和脂肪族類化合物[2]，具有抗腫瘤、保肝、抗氧化、解熱及抗炎等多種藥理作用[2-3]。本文對近年來半枝蓮質(zhì)量評價(jià)方面的研究結(jié)果進(jìn)行綜述，以期為更好地開發(fā)和利用該藥材提供參考依據(jù)。

1 性狀和顯微鑒定

孟楣等[4]對半枝蓮采集品的莖和葉橫切面、全草粉末的顯微特征進(jìn)行觀察，找出其顯微鑒別特征。楊祚榮等[5]主要通過分析性狀特征對半枝蓮與半邊蓮進(jìn)行鑒別。付桂芳等[6]對半枝蓮及其混淆品并頭黃芩、直萼黃芩、韓信草、荔枝草和半邊蓮等6種藥材進(jìn)行了性狀以及全草粉末、橫切面顯微特征的比較，為藥材的鑒定提供依據(jù)。

2 指紋圖譜研究

陳香愛等[7]建立了半枝蓮藥材的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜。采用C18柱，以甲醇-乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為280 nm，樣品用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇超聲提取，對30批藥材樣品進(jìn)行檢測。建立了半枝蓮HPLC指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了14個(gè)共有峰，鑒定了其中4個(gè)峰，分別為野黃芩苷、木犀草素、黃芩素和漢黃芩素，24批半枝蓮藥材的相似度均在0.7以上，6批混淆品均在0.4以下。HPLC指紋圖譜鑒別半枝蓮及其混淆品具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)及方法簡便等特點(diǎn)，可作為半枝蓮藥材的鑒別方法。

王慧彬等[8]在已確定的半枝蓮HPLC指紋圖譜基礎(chǔ)上，通過高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，HPLC/Q-TOF-MS)技術(shù)，對13個(gè)共有峰進(jìn)行鑒定。采用 Discovery C18柱，以甲醇-0.5 mL·L-1甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為335 nm，采用ESI源，正離子模式檢測。通過一級和二級質(zhì)譜，得出黃酮類成分的裂解方式，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了其中10個(gè)共有峰。

趙偉偉等[9]建立了半枝蓮藥材的HPLC指紋圖譜，樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取，采用C18柱，以乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為270 nm。結(jié)果顯示，其精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，以野黃芩苷作為對照峰，標(biāo)定了13個(gè)特征峰為共有峰。采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行評價(jià)，8份藥材的相似度為0.953～0.768，主成分分析獲得2個(gè)主要成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.347%。應(yīng)用指紋圖譜并結(jié)合主成分分析，能為半枝蓮藥材的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

3 含量測定

3.1 有效部位的含量

郗玉玲等[10]通過紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry，UV)測定半枝蓮中總黃酮含量，樣品用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇加熱回流提取，用碳酸鈣吸附除去鞣質(zhì)和葉綠素，以野黃芩苷為對照品，在335 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果顯示，野黃芩苷質(zhì)量濃度在0.002 6～0.013 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，加樣回收率為97.59%。任強(qiáng)等[11]采用UV法測定不同產(chǎn)地半枝蓮中的總黃酮含量。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇超聲提取，以黃芩苷為對照品，在277 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，結(jié)果顯示，黃芩苷質(zhì)量濃度在2.4～12.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為94.3%～96.8%，對不同產(chǎn)地的15批藥材樣品進(jìn)行測定，總黃酮含量分別為0.97%～2.70%，含量差異較為明顯，其原因可能是半枝蓮產(chǎn)地的土壤、氣候和光照等多種因素導(dǎo)致總黃酮含量的差異。陳桂等[12]對利用超聲輔助半仿生法提取半枝蓮總黃酮的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行考察，采用單因素考察超聲功率、提取時(shí)間、料液質(zhì)量比、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對提取率的影響，得出最佳實(shí)驗(yàn)條件為：超聲功率60 W、提取時(shí)間30 min、料液質(zhì)量比為1∶30、提取溫度60 ℃、提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，在該條件下總黃酮提取率為2.14%。張洪坤等[13]采用紫外分光光度法測定不同采收期半枝蓮中總黃酮含量，以野黃芩苷為對照品，結(jié)果顯示，不同采收期總黃酮含量由大到小依次是7、9、5月，不同生長期含量由大到小依次是開花期、開花前和果實(shí)期。

夏于芬等[14]通過紫外分光光度法對貴州不同產(chǎn)地半枝蓮中的多糖含量進(jìn)行測定，樣品經(jīng)石油醚脫脂，加入復(fù)合酶酶解，之后加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀多糖，以D-無水葡萄糖作為對照品，在490 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，結(jié)果顯示，D-無水葡萄糖的質(zhì)量濃度在2.44～16.50 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為98.55%。測定了11 批樣品，結(jié)果表明，貴州省東部地區(qū)產(chǎn)出的半枝蓮多糖含量高于西部地區(qū)，貴州東南部鎮(zhèn)遠(yuǎn)一帶產(chǎn)出的半枝蓮藥材多糖含量最高，該研究可為黔產(chǎn)半枝蓮的種植與開發(fā)提供參考。李潔等[15]采用UV法測定了不同產(chǎn)地半枝蓮中的多糖含量，結(jié)果顯示，云南墨江、江蘇南通、湖南華寧、福建永定、安徽利辛、廣東蕉嶺、江西南昌、廣西龍勝、湖北洪湖和浙江慶元半枝蓮中多糖的含量分別為8.12%、7.61%、6.61%、6.07%、5.84%、4.61%、3.15%、2.69%、2.65%、2.34%，其中以云南墨江半枝蓮中多糖含量最高。表明不同產(chǎn)地和栽培方式對多糖含量有較大影響，含量差異可能與植物的生長環(huán)境、溫度和濕度等多種因素有關(guān)。

3.2 藥材中單體成分的含量測定

3.2.1HPLC法 鄒箴蕾等[16]對不同采收時(shí)間半枝蓮中的野黃芩苷含量進(jìn)行測定，采用Lichrospher C18柱，流動相為甲醇-30 mL·L-1乙酸水溶液(29∶71)，檢測波長為335 nm，結(jié)果顯示，6、7、8月采收的半枝蓮中野黃芩苷含量分別為0.59%、0.78%、0.16%，7月含量最高，建議在莖葉茂盛的7月采收。

李潔[17]采用HPLC法測定半枝蓮不同藥用部位野黃芩苷的含量，結(jié)果顯示，野黃芩苷在0.38～3.80 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.52%，不同藥用部位含量差異較大，其中以葉含量最高，為0.842%，以根含量最低，為0.223%，含量順序由高到低依次為葉、莖、全草、花和根，為臨床分部位入藥提供一定依據(jù)。

劉小莉等[18]通過HPLC-電化學(xué)檢測(high performance liquid chromatography -electrochemical detection，HPLC-ECD)法，建立了同時(shí)測定半枝蓮中原兒茶酸、p-香豆酸和木犀草素含量的方法。采用Gemini-C18柱，流動相為甲醇-30 mL·L-1醋酸水溶液，梯度洗脫，電化學(xué)檢測器的工作電位為0.9 V，樣品提取采用索氏提取法，先用石油醚(60～90 ℃)提取，再用甲醇提取。結(jié)果顯示，原兒茶酸、p-香豆酸和木犀草素的線性范圍分別為0.14～11.28、0.29～9.25、0.58～9.31 μg·mL-1，加樣回收率分別為97.7%、100.1%、100.9%，測定的3批商品半枝蓮中原兒茶酸、p-香豆酸和木犀草素的含量分別在221.4～281.9、92.5～141.1、139.4～155.8 μg·g-1范圍內(nèi)。

康安等[19]建立了同時(shí)測定半枝蓮中木犀草素、芹菜素、漢黃芩素、半枝蓮生物堿A和半枝蓮生物堿B的方法。樣品先后用石油醚、甲醇索氏提取，采用Phenomenon C18柱，流動相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測波長為355 nm(木犀草素、芹菜素)、254 nm(漢黃芩素、半枝蓮生物堿A和半枝蓮生物堿B)。結(jié)果顯示，5種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為97.1%～102.4%，測定6批樣品中木犀草素、芹菜素、漢黃芩素、半枝蓮生物堿A和半枝蓮生物堿B的含量分別在3.45～6.80、12.24～27.13、2.21～3.91、8.46～16.74、4.57～8.65 μg·g-1范圍內(nèi)。

WEI M C等[20]建立了以熱回流-超聲輔助提取法提取半枝蓮藥材，通過HPLC技術(shù)測定半枝蓮中芹菜素、黃芩苷和木犀草素3種黃酮類成分含量的方法。經(jīng)優(yōu)化后的提取條件為：超聲波頻率為40 kHz，功率為185 W，提取溫度為50 ℃，料液比為12∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次。與傳統(tǒng)的熱回流提取法相比，該方法能縮短提取時(shí)間，降低提取溫度和溶劑消耗，且目標(biāo)成分的提取率更高。測定5批藥材中芹菜素、黃芩苷和木犀草素的含量分別為1.146～1.984、0.127～0.206、0.289～0.438 mg·g-1。

殷文杰等[21]測定半枝蓮中熊果酸的含量，采用Agilent SB-C18柱，以甲醇-20 mL·L-1乙酸水溶液為流動相，檢測波長為210 nm，結(jié)果顯示，熊果酸在0.024 5～0.491 8 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為98.7%，測定得5批藥材中熊果酸含量為0.656～2.846 mg·g-1。

劉勇等[22]建立了半枝蓮中原兒茶酸和香草酸的含量測定方法。樣品用甲醇加熱回流提取，采用Zorbax SB-C18柱，以甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液為流動相，檢測波長為260 nm，結(jié)果顯示，原兒茶酸和香草酸質(zhì)量濃度分別在2.66～31.92、2.86～34.32 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為0.56、0.57 μg·mL-1，回收率分別為101.4%、99.4%，對4個(gè)產(chǎn)地的5批藥材進(jìn)行測定，原兒茶酸和香草酸的含量分別為28.5～68.6、38.9～90.2 μg·g-1，其中產(chǎn)地為江蘇的含量均較高。

付小凱等[23]建立了同時(shí)測定半枝蓮中對香豆酸和肉桂酸含量的方法。采用 Eclipse SB-C18柱，流動相為乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為310 nm(對香豆酸)、280 nm(肉桂酸)，結(jié)果顯示，香豆酸和肉桂酸分別在0.148～1.776、0.062～0.992 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為99.4%、99.3%。對6個(gè)產(chǎn)地的8批藥材進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，香豆酸和肉桂酸含量分別為99.3～197.5、37.9～92.4 μg·g-1，產(chǎn)地為湖北的樣品中2種成分含量總體優(yōu)于其他產(chǎn)地樣品。

王治陽等[24]建立了同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素8個(gè)黃酮類成分含量的方法。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取，采用Agilent ZORBAX SB-C18柱，以乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為350 nm。結(jié)果顯示，8個(gè)成分在各自濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為98.9%～99.9%，對來自8個(gè)產(chǎn)地的藥材樣品進(jìn)行測定，野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素的含量分別為1.73～5.73、0.61～2.73、0.51～2.31、0.69～1.97、0.29～1.13、0.29～1.04、0.74～2.37 mg·g-1。不同產(chǎn)地的含量差異較大，產(chǎn)地為安徽亳州、河南鄭州以及甘肅平?jīng)龅臉悠泛肯鄬^高。該研究能為半枝蓮藥材及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，并為該藥材的栽培提供參考。

田新宇等[25]建立了測定半枝蓮中野黃芩苷、芹菜素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、野黃芩素、異高山黃芩素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、4′-羥基漢黃芩素和芹菜素7種黃酮類成分含量的HPLC方法。樣品用甲醇超聲提取，采用Fortis C18柱，野黃芩苷、芹菜素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的流動相為乙腈-10 mL·L-1乙酸水溶液，野黃芩素、異高山黃芩素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、4′-羥基漢黃芩素和芹菜素的流動相為甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液，均為梯度洗脫，檢測波長為335 nm。結(jié)果各成分線性關(guān)系良好，加樣回收率為96.15%～103.47%。

趙一帆等[26]建立了測定半枝蓮中二萜類生物堿scutebarbatine A的方法。采用Agilent-Eclipse XDB-C18柱，流動相為甲醇-水(60∶40)，檢測波長為260 nm，樣品加入二氯甲烷提取，結(jié)果顯示，scutebarbatine A線性范圍為0.030 34～1.213 6 μg，加樣回收率為100.2%。測定了不同產(chǎn)地的10批藥材，scutebarbatine A含量為19.209～215.617 μg·g-1，產(chǎn)地為江西省贛州、南昌和四川省的藥材中該成分含量較高，而江蘇省內(nèi)不同地區(qū)的含量具有明顯差異，可能與不同緯度、不同氣候條件及地理位置差異有關(guān)。

張洪坤等[13]測定半枝蓮中野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的含量，并以水溶性、醇溶性浸出物為評價(jià)指標(biāo)。采用YMC Hydrosphere C18柱，流動相為甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為335 nm，結(jié)果顯示，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的加樣回收率分別為100.8%、95.3%、95.2%、92.1%，7月開花期采收的半枝蓮中野黃芩苷和浸出物含量最高，而木犀草素、芹菜素含量表現(xiàn)出不同的規(guī)律，木犀草素含量隨著月份的推后而升高，芹菜素含量則相反，頭茬半枝蓮含量最高，但與7月采收期的差別均不大。因此建議應(yīng)以7月開花期為半枝蓮的最佳采收期。

3.2.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)法 焦燕等[27]采用液相色譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-secondary mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)，建立了測定半枝蓮中野黃芩苷和芹菜素含量的方法。采用Discovery C18柱，以乙腈-1 mL·L-1醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為335 nm，采用電噴霧電離源(ESI)、負(fù)離子模式檢測，野黃芩苷與芹菜素選定的母離子和子離子分別為m/z 461/285，m/z 269/117，質(zhì)量濃度在2.6～72.7、2.3～63.8 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，測定了12個(gè)產(chǎn)地的半枝蓮藥材12批，結(jié)果顯示，野黃芩苷和芹菜素的含量分別為0.03%～0.39%、0.02%～0.30%，回收率分別為99.1%、97.3%。

YANG Y C等[28]采用加熱回流提取與超聲輔助提取聯(lián)用技術(shù)對半枝蓮進(jìn)行提取，通過LC-MS法測定藥材中的芹菜素、黃芩素、黃芩苷、木犀草素、柚皮素和漢黃芩素6個(gè)黃酮類成分，這種提取方法對于黃酮類成分的提取率分別比超聲輔助提取法和回流提取法高8.1%～9.2%、18.3%～21.1%，6個(gè)成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限為0.039～0.078 μg·mL-1，定量限為0.113～0.244 μg·mL-1。

3.2.3氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法 曹英夕等[29]對不同產(chǎn)地半枝蓮的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較，分析了江蘇、廣西、江西、湖南和四川省5個(gè)產(chǎn)地半枝蓮的揮發(fā)性成分，用歸一化法計(jì)算各成分的相對含量。結(jié)果顯示，從5個(gè)產(chǎn)地的半枝蓮中共鑒定出揮發(fā)性化合物45個(gè)，有13個(gè)共有成分，分別為1-辛烯-3-醇、3, 7-二甲基-1, 6-辛二烯-3-醇甲酸酯、苯乙醇、甘菊環(huán)、2-甲氧基-3-(2-丙烯)苯酚、1, 2-二甲氧基-4-(2-丙烯)苯、十五烷、2-甲基-1-(1, 1-二甲基乙基)-2-甲基-1, 3-丙二醇丙酸酯、正十六烷、6, 10, 14-三甲基-2-十五烷酮、十六酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯和十六烷酸，這13個(gè)共有峰可作為半枝蓮揮發(fā)性成分中特征性指標(biāo)成分，但不同產(chǎn)地藥材中所含揮發(fā)性主成分有較大差異。

王兆玉等[30]對半枝蓮全草揮發(fā)油成分進(jìn)行提取，采用GC-MS法分析，并用歸一化法計(jì)算各成分相對含量。結(jié)果分析得到83個(gè)峰，確定了其中54種化合物(占65.06%)，其中含量占1%以上的化合物有11種，總相對含量為70.21%，含量相對最高的3種物質(zhì)依次是棕櫚酸(占34.07%)、亞油酸(占13.21%)、葉綠醇(占5.90%)。

3.2.4毛細(xì)管膠束電動色譜法 米璇等[31]建立了同時(shí)檢測半枝蓮及其膏劑中黃芩素、柚皮素、漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、木犀草素和原兒茶酸7種有效成分的方法。樣品加入甲醇超聲提取。分離運(yùn)行緩沖液為50 mmol·L-1硼砂溶液-0.20 mol·L-1硼酸溶液(pH 8.4)，含8.5 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉，分離電壓為25 kV，檢測波長為260、335 nm。7種成分可在12 min內(nèi)達(dá)到基線分離，各成分在8×10-6～3.2×10-4mol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限在7.0×10-8～2.0×10-6mol·L-1范圍內(nèi)，回收率均大于85%。

3.3 微量元素的含量測定

席榮英等[32]采用原子吸收分光光度法對半枝蓮中的鐵、銅、鋅、錳、鎂、硒、鍺和鉬8種微量元素進(jìn)行測定，樣品加入濃硝酸消解后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，半枝蓮含有豐富的人體必需微量元素，其中鎂的含量最高，鐵、銅較高，其次是鋅、錳等。

4 結(jié)語

半枝蓮的質(zhì)量評價(jià)研究主要包括性狀和顯微鑒定、指紋圖譜研究及含量測定，其中含量測定報(bào)道較多，但也存在一些問題。對半枝蓮指紋圖譜中共有峰的指認(rèn)還需深入，已有報(bào)道指認(rèn)的幾乎均為黃酮類，需加強(qiáng)其他類型化學(xué)成分的鑒定。目前黃酮類成分含量測定的研究較多，僅有少數(shù)測定生物堿或酚酸類，需加強(qiáng)藥材中不同類型化學(xué)成分同時(shí)定量分析的研究，還需結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)測定其中微量成分，LC-MS/MS法具有靈敏度高、操作簡便和分離效果好等優(yōu)勢，廣泛用于復(fù)雜體系中微痕量成分的準(zhǔn)確定量[33]。僅有1篇報(bào)道采用原子吸收分光光度法測定半枝蓮中8種無機(jī)元素，可嘗試將電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)法應(yīng)用于元素測定，ICP-MS法是目前公認(rèn)的能同時(shí)測定多種元素的常用方法，具有分析速度快、靈敏度高和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，解決了原子吸收光譜對元素逐個(gè)分析的問題[34]。應(yīng)建立半枝蓮藥材中多種無機(jī)元素的含量測定方法，并測定不同產(chǎn)地、不同采收期和生長期樣品，比較所含微量元素差異，為全面評價(jià)藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。