精子DNA 碎片率及頂體酶活性對男性不育的診斷價值

韋海燕 莫鳳明 鄧穎蕓

（河池市人民醫(yī)院 廣西河池 547000）

引言

男性不育是高發(fā)于男性群體的生殖系統(tǒng)疾病，是指夫妻生活正常，且無避孕措施，因男性因素造成不育癥狀。其致病因素與性病史、吸煙飲酒和環(huán)境污染有關(guān),多需要通過精液質(zhì)量檢測診斷該病，而后開展針對性治療[1]。DFI（DNA 碎片指數(shù)）是精液質(zhì)量的常用診斷指標(biāo)，可以評估疾病程度。頂體酶活性可以判斷精子活性，其指數(shù)降低則精子具有較差的穿越力，進(jìn)而降低精子質(zhì)量?，F(xiàn)階段，以上兩項指標(biāo)是男性不育的常規(guī)診斷指標(biāo)，便于疾病的早期治療。為此，本研究選取1727 例男性篩查者，分析以上兩項指標(biāo)的診斷效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016 年6 月～2021 年12 月入院診斷的1727 例男性篩查者，其中男性不育患者481 例。

根據(jù)DFI 分組，一組306 例，不育時長為9 個月～3 年，平均（1.24±0.48）年。二組113 例，不育時長為10 個月～3 年，平均（1.30±0.44）年。三組35例，不育時長為11 個月～4 年，平均（1.30±0.34）年。四組27 例，不育時長為8 個月～4 年，平均（1.51±0.33）年。

根據(jù)頂體酶活性分組，≤48.2U/106為27 例，不育時長為8 個月～3 年，平均（1.17±0.66）年；＞48.2U/106為416 例，不育時長為10 個月～4 年，平均（1.21±0.69）年。經(jīng)假設(shè)檢驗并無差異，P＞0.05。

1.2 方法

根據(jù)精液檢查與處理實驗室手冊對精液進(jìn)行常規(guī)檢測，用改良的牛鮑氏計數(shù)板測量精液密度，采取手工法計數(shù)。用快速染色法（Diff-Quik）測定精子形態(tài)學(xué)特點，正常形態(tài)4%為參考值的具體下限。所有操作人員經(jīng)過系統(tǒng)化培訓(xùn)以后上崗，具備熟練的操作能力。頂體酶活性檢測采取頂體酶試劑盒，根據(jù)改良后的Kennedy 法實施檢測，將精液標(biāo)本混勻以后進(jìn)行計數(shù)操作，使每個反應(yīng)管內(nèi)部的精子個數(shù)大概是7.5×106個，對各個標(biāo)本設(shè)置對照以及反應(yīng)管，然后添加反應(yīng)液以及抑制劑。在對照管內(nèi)混入反應(yīng)終止液，放置在24℃條件下，1 小時以后比色。其正常值是48.2 至218.7μU/106。DFI 檢測方法為：用碎片染色試劑盒檢測精子DNA 損傷度，采取SCD 法進(jìn)行檢測，取新鮮精液以后使其徹底液化，然后經(jīng)PBS稀釋精液使其濃度在1 至10×106/毫升，取30 微升混入低熔點（37℃）瓊脂糖凝膠內(nèi)，混合均勻后再取20 微升凝膠混合液滴在載玻片（預(yù)處理）上，蓋玻片規(guī)格22×22 毫米，于4℃條件下放置5 分鐘。蓋玻片移除以后置入DNA 變性液, 然后室溫下孵育，時間為7 分鐘。玻片取出以后泡在裂解液內(nèi),繼續(xù)孵育25 分鐘。蒸餾水內(nèi)放置5 分鐘,將殘余的裂解液洗去后將玻片置入70%乙醇、90%乙醇與100%乙醇內(nèi)，脫水2 分鐘。晾干以后經(jīng)染色液覆蓋玻片，時間10～15 分鐘，經(jīng)自來水沖去染液，再晾干。在200 倍的光學(xué)顯微鏡之下觀察標(biāo)本，評價核周圍的暈輪直徑、精子核、暈輪直徑，而后算出DFI。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察組間的年齡差異、精子密度差異、頂體酶活性、前向運動率、正常精子率、非前向運動率指標(biāo)。評價DFI 以及頂體酶活性與精子參數(shù)之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理經(jīng)由SPSS23.0 軟件完成，計量數(shù)據(jù)經(jīng)t 值或F 值對比與檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)經(jīng)χ2值對比與檢驗，相關(guān)性采取Pearson（滿足正態(tài)性）檢驗，統(tǒng)計學(xué)有意義則P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 DFI 不同組別的精子參數(shù)比較

不同DFI 組間的年齡、精子密度、頂體酶活性、前向運動率、正常精子率對比存在差異，P＜0.05。見表1。

表1 DFI 不同組別的精子參數(shù)比較（）

表1 DFI 不同組別的精子參數(shù)比較（）

分組例數(shù)年齡（歲） 精子密度（106/ml） 頂體酶活性（μU/106） 前向運動率（%）正常精子率（%） 非前向運動率（%）一組30636.29±2.6775二組11337.92±2.9976三組3539.01±2.3478.28±4.26119.75±9.9736.38±3.749.67±0.7420.36±2.97.33±4.95104.53±9.2230.03±3.449.32±0.6720.78±2.99.74±4.8593.33±8.6728.71±1.767.94±1.3318.25±1.81四組2742.67±2.99111.21±9.7772.65±4.6216.27±2.377.15±0.8216.94±2.18 F-18.62417.51737.68121.3478.3419.334 P-0.0000.0000.0000.0000.0380.027

2.2 頂體酶活性不同組別的精子參數(shù)比較

根據(jù)頂體酶活性分組，對比組間的精子密度、前向運動率、DFI、正常精子率與非前向運動率有差異，P＜0.05。見表2。

表2 頂體酶活性不同組別的精子參數(shù)比較（）

表2 頂體酶活性不同組別的精子參數(shù)比較（）

分組例數(shù)年齡（歲）精子密度（106/ml） 前向運動率（%）DFI（%）正常精子率（%） 非前向運動率（%）≤48.2μU/1062738.89±3.2454.70±4.7119.69±1.8518.15±1.777.11±1.0517.35±1.67＞48.2μU/10641637.37±3.2980.48±9.4734.33±2.069.94±1.869.54±1.4420.09±1.80 t--2.32814.02235.99122.2888.617 P--0.0200.0000.0000.0000.000

2.3 DFI、頂體酶活性與精子參數(shù)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析可見，DFI 與精子密度、前向運動率、正常精子率、頂體酶活性具有負(fù)相關(guān)性，P值均為負(fù)值，頂體酶活性與精子密度、前向運動率、正常精子率具有正相關(guān)性，P值為正值，與DFI 具有負(fù)相關(guān)性，P值為負(fù)值。見表3。

表3 DFI、頂體酶活性與精子參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

有數(shù)據(jù)顯示，男性因素導(dǎo)致不育的概率約是50%，多表現(xiàn)為精液異常。精液常規(guī)檢驗是該病的初步診斷方法，可以通過精液實驗室指標(biāo)評估其質(zhì)量。但常規(guī)檢驗具有局限性，難以準(zhǔn)確測出男性不育患病率[2]。此外，常規(guī)檢驗難以準(zhǔn)確判斷受精能力以及精子活力、功能,無法評估疾病預(yù)后，需要尋求更加準(zhǔn)確和全面的診斷方式?，F(xiàn)階段，光學(xué)顯微鏡是精子質(zhì)量的新型檢測法，可以評價精子活力、存活率、形態(tài)學(xué)與濃度，彌補(bǔ)常規(guī)檢驗的結(jié)果誤差，且有可靠性優(yōu)勢[3]。DFI 與頂體酶活性是常用的顯微鏡檢測指標(biāo)，對于精子質(zhì)量的評價效果理想。

人體精子染色質(zhì)包括3 個結(jié)構(gòu)，即：核基質(zhì)結(jié)合域、螺線管和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以上機(jī)構(gòu)可直接影響精子功能。以上結(jié)構(gòu)的生理功能有所差異，其結(jié)構(gòu)完整可以干擾受精過程與胚胎發(fā)育健康度[4]?；诖耍R床認(rèn)為DNA 完整性能夠作為男性不育的有效診斷指標(biāo)。但DFI 發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，可能與染色質(zhì)包裝、異常凋亡與氧壓脅迫相關(guān)，是綜合因素的作用結(jié)果[5]。本研究中，表1 可見DFI 水平與年齡相關(guān)，且DFI 水平越高，患者的年齡越大。原因是年齡較大者其附睪組織的抗氧自由基功能下降，睪丸生精能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 修復(fù)功能減弱。此外，不同DFI 組間的精子密度、頂體酶活性、前向運動率、正常精子率對比存在差異P＜0.05。相關(guān)系分析結(jié)果中DFI 與精子密度、前向運動率、正常精子率、頂體酶活性具有負(fù)相關(guān)性。DFI 相關(guān)性分析結(jié)果可見精子核DNA可能與線粒體功能相關(guān)，若DNA 損傷較重，則會導(dǎo)致線粒體的代謝能力下降，進(jìn)而造成弱精子癥。DFI可以評價精子的正常形態(tài)，其與精子正常形態(tài)率負(fù)相關(guān)，則DFI 升高，精子形態(tài)會發(fā)生改變，可以將DFI 作為精子畸形度的評價指標(biāo)。DFI 與頂體酶活性同樣負(fù)相關(guān)，原因是精子遺傳物質(zhì)在破壞以后，蛋白合成以及轉(zhuǎn)錄過程均會發(fā)生改變，這會影響頂體酶生成量，甚至難以合成酶原激活物質(zhì)，無法激活頂體酶，進(jìn)而降低其活性。精子密度與DFI 具有負(fù)相關(guān)性，說明DFI 可以反映精子的運動力和產(chǎn)生量，評價男性生育能力。

結(jié)果中，不同頂體酶活性組的精子密度、前向運動率、DFI、正常精子率和非前向運動率對比有差異P＜0.05。頂體酶活性與精子密度、前向運動率、正常精子率具有正相關(guān)性，與DFI 具有負(fù)相關(guān)性。說明頂體酶活性同樣可以評估精子質(zhì)量。本研究采取化學(xué)比色法進(jìn)行檢驗，可以獲取精準(zhǔn)度高的診斷數(shù)據(jù)。此外，以上指標(biāo)與頂體酶活性正相關(guān),說明頂體酶活性可以監(jiān)測精子功能。正常形態(tài)率是精子形態(tài)的評估指標(biāo)，其與頂體酶活性正相關(guān)說明頂體酶活性可以評價精子形態(tài)畸形率，評估精子所表現(xiàn)的多重畸形度。這一相關(guān)性分析可以全面評價頂體酶活性、DFI對于精子形態(tài)學(xué)的評估效果，綜合反映精子形態(tài)。而頂體酶活性與DFI 負(fù)相關(guān)說明二者相互影響，雖無法明確具體的影響機(jī)制，但可通過兩項指標(biāo)的聯(lián)合檢驗提高疾病診斷率。

綜上，DFI 與頂體酶活性可以有效檢出男性不育，其診斷結(jié)果比較客觀和科學(xué)，能夠全方位觀察精子的形態(tài)學(xué)特征，提供更為全面的診斷數(shù)據(jù)。