基于肽組學(xué)的大豆低聚肽制備穩(wěn)定性評價(jià)

郁曉藝 徐巨才 伍 鎣 劉萬順 郭 丹 李曉敏

(1.完美〔廣東〕日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020；3.江門市大健康國際創(chuàng)新研究院，廣東 江門 529020)

大豆低聚肽主要指大豆蛋白經(jīng)深度生物酶解技術(shù)處理后所形成的酶解產(chǎn)物，因具有綠色、安全、無毒副作用等多種優(yōu)良特點(diǎn)，備受廣大消費(fèi)者和科研學(xué)者青睞[1]。大豆低聚肽的分子量大多在1 000 Da以下，在人體消化系統(tǒng)中具有較好的消化吸收特性，且基本保留了大豆蛋白原有的優(yōu)質(zhì)氨基酸組成，同時(shí)還具備了遠(yuǎn)優(yōu)于大豆蛋白的溶解性和生理活性[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大豆低聚肽具有抗氧化[3]、降血壓[4]、抗疲勞[5]等多種生理活性，極大地促進(jìn)了大豆低聚肽產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。與此同時(shí)，大豆低聚肽的應(yīng)用也在一定程度上改善了國內(nèi)大豆粕或大豆蛋白資源的利用情況，為充分挖掘低值蛋白資源的營養(yǎng)價(jià)值、功能價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了重要途徑[6]。

近年來，國內(nèi)外相關(guān)研究大多聚焦于目標(biāo)多肽的構(gòu)效關(guān)系和活性作用機(jī)理[7-9]，而較少關(guān)注制備過程中多肽的組成及變化情況。大豆低聚肽作為較早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的植源性低聚肽之一，至今仍主要依賴于水解度、氨基酸、肽分子量分布等間接或宏觀技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制或評價(jià)[10-12]，而關(guān)于其多肽的組成情況一直尚未見相關(guān)報(bào)道。由于缺失酶解產(chǎn)物中多肽的分子組成信息，上述技術(shù)指標(biāo)在進(jìn)行原料質(zhì)控時(shí)，常呈現(xiàn)為特異性不足，為多肽原料供應(yīng)的穩(wěn)定性評價(jià)和品質(zhì)鑒別帶來一定困擾[13]。尤其隨著近年來多肽制備技術(shù)的不斷推廣和逐漸普及，市場開始出現(xiàn)魚龍混雜、品質(zhì)良莠不齊等現(xiàn)象。為保障和促進(jìn)多肽產(chǎn)業(yè)的規(guī)范、良性發(fā)展，對多肽原料開展更精準(zhǔn)的穩(wěn)定性評價(jià)和品質(zhì)鑒別研究已迫在眉睫。

研究擬以相同工藝不同生產(chǎn)批次的大豆低聚肽為研究對象，利用質(zhì)譜多肽組學(xué)分析技術(shù)解析原料的多肽組成，再結(jié)合集合分析、主成分分析等探討批次間原料的共性與差異性，以期為多肽原料的制備穩(wěn)定性評價(jià)提供新思路，并為相關(guān)原料的精準(zhǔn)質(zhì)控提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆低聚肽(A、B、C、D、E共5批次樣品)：完美(廣東)日用品有限公司；

乙腈、甲酸：質(zhì)譜純，美國Sigma公司；

超純水：實(shí)驗(yàn)室自制；

色譜柱：1 × 100 mm HSS T3(1.8 μm，1 mm)，美國Waters公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

十萬位分析電子天平：Secura125-1CN型，德國賽多利斯公司；

高分辨液相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：X500 LC-ESI-Q-TOF型，美國AB SCIEX公司；

純水機(jī)：Milli-Q型；德國Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 以大豆低聚肽為樣品，用超純水配置成2 mg/mL溶液，充分溶解后過0.22 μm濾膜上機(jī)分析。

1.3.2 高分辨液質(zhì)聯(lián)用檢測分析 參照Lenco等[14]的方法修改如下：流動(dòng)相由體積比1∶999的甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成，洗脫方法為：0.00～4.00 min 5.0% B，4.00～6.00 min 5.0%～10.0% B，6.00～30.00 min 10.0%～40.0% B，30.00～34.00 min 40.0%～90.0% B，34.00～40.00 min 90% B，40.00～42.00 min 90.0%～5.0% B，42.00～52.00 min，5.0% B，流速0.05 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，柱溫40 ℃；質(zhì)譜檢測方法：掃描周期0.642 s，ESI離子源溫度500 ℃，正離子模式，噴霧電壓5 500 V，TOF一級掃描范圍100～1 200 Da，二級掃描范圍50～1 200 Da，工作模式IDA，最大候選離子數(shù)4，開啟動(dòng)態(tài)排除，其余參數(shù)使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法默認(rèn)值。

1.3.3 多肽組學(xué)鑒定與分析 使用ProteoWizard 3.0(美國ProteoWizard公司)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)(wiff2)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換(Mgf)，再分別采用Proteome Discoverer 2.4(美國Thermo公司)進(jìn)行長肽鑒定處理和PepOS多肽組學(xué)分析軟件1.0(廣東省五邑大學(xué))進(jìn)行短肽鑒定處理。其中Proteome Discoverer 2.4的參數(shù)設(shè)置為多肽長度6～25，一級母離子誤差0.02 Da，二級子離子誤差0.02 Da，解譜引擎為Sequest，蛋白序列庫為從UniProt下載得到(https://www.uniprot.org/，檢索關(guān)鍵詞“soybean”，下載日期2021年12月1日)，鑒定離子簇類型為a、b和y離子簇，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率1%，其他參數(shù)使用默認(rèn)設(shè)置；PepOS參數(shù)設(shè)置為多肽長度2～5，一級母離子誤差0.02 Da，二級子離子誤差0.02 Da，解譜引擎為Exaust，鑒定離子簇類型為a、b和y離子簇，評分閾值為100分(須至少匹配一種混和離子簇)，并行CPU核心數(shù)12。不同批次間樣品多肽序列交、并集運(yùn)算采用Python 3.8、Matlab2015A進(jìn)行。多肽離子批量抽提采用SCIEX OS 2.0(美國AB SCIEX)，高豐度多肽手動(dòng)序列或結(jié)構(gòu)確認(rèn)采用Biotools 3.2(德國Bruker公司)。

1.3.4 主成分分析 基于樣品在質(zhì)譜中所檢測到的一級母離子，使用MarkerView 1.3(美國AB SCIEX)對不同樣品進(jìn)行PCA主成分分析(Principal Component Analysis)，保留時(shí)間差異閾值設(shè)置0.50 min，質(zhì)荷比差異閾值0.01 Da，最大獲取峰數(shù)量3 000，豐度閾值設(shè)置為2 000，主成分分析因子權(quán)重方法為Logarithm，評分方法為Range Scale。

1.3.5 數(shù)據(jù)輔助處理與可視化 采用Excel 2013、Origin 2018、Python 3.8、Matlab 2015a等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輔助處理與可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同批次低聚肽的液質(zhì)聯(lián)用分離

由圖1可知，相同工藝不同批次的大豆低聚肽熱度宏觀分布基本一致，但存在細(xì)小差異，可能是由于色譜峰的漂移或自身組成差異所致。樣品在T3色譜柱中的分離區(qū)間主要集中于1～25 min，而在25 min后的高有機(jī)相洗脫區(qū)域僅極少組分流出，這主要與食源性低聚肽中極性肽段較多有關(guān)。食源性低聚肽在制備過程中，所用酶制劑常為粗酶，且作用位點(diǎn)大多廣泛，故酶解產(chǎn)物中多肽的特異性較差，且產(chǎn)物中易存在大量的極性多肽[10,15]。這些多肽在反相色譜分離過程中，常在洗脫初期出現(xiàn)一簇或多簇強(qiáng)響應(yīng)洗脫峰。T3色譜柱在常規(guī)C18色譜柱的基礎(chǔ)上，采用鍵合技術(shù)敲除柱填料表面的部分烷基疏水鏈，因而較常規(guī)C18色譜柱更適于食源性低聚肽的液質(zhì)分離[16]。此外，試驗(yàn)中，所用T3色譜柱為窄內(nèi)徑色譜柱(內(nèi)徑僅為1 mm)，對于提升多肽離子在微升級質(zhì)譜離子源中的靈敏度亦具有重要作用[14]。

圖1 不同批次大豆低聚肽的熱度圖

2.2 多肽組學(xué)分析效果評價(jià)

對上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多肽組學(xué)分析鑒定，統(tǒng)計(jì)各批次樣品的譜圖和多肽鑒定情況如圖2所示。其中，譜圖鑒定量(Peptide Spectra Matches，PSMs)描述了不同批次樣品在分析過程中所采集到的多肽二級譜圖鑒定量，包含重復(fù)鑒定為同一肽段的二級譜圖[17]；多肽鑒定量描述了不同批次樣品經(jīng)分析鑒定得到的非重復(fù)性多肽數(shù)量；由圖2可知，不同批次樣品的組學(xué)分析效果相近，平均每個(gè)樣品有約2 000張譜圖(PSMs)得到鑒定，平均非重復(fù)性多肽鑒定數(shù)量接近1 000，平均每條肽段的鑒定支持譜圖數(shù)量約為2，說明鑒定結(jié)果具有良好的譜圖數(shù)據(jù)支撐，可靠性較高；不同批次樣品的制備具有較好的宏觀穩(wěn)定性。

圖2 多肽鑒定效果評價(jià)

值得注意的是，上述已鑒定多肽大部分為短肽(長度2～5)，僅有極少部分多肽為長肽。推測這主要與食源性蛋白質(zhì)在酶解過程中常采用廣譜性粗酶有關(guān)。廣譜性粗酶純度較低，同時(shí)作用位點(diǎn)較為廣泛，因而其作用蛋白質(zhì)后所得產(chǎn)物常呈現(xiàn)為大量的短肽[18]。為進(jìn)一步對上述現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證，對樣品A的多肽組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，低聚肽樣品A的肽段分布以2～5為主，尤以3～5居多；低聚肽樣品A中大部分多肽長度為2～5，尤以2～4的離子峰面積占比較高。這充分驗(yàn)證了上述理論推測，同時(shí)，大量短肽的存在亦較好地解釋了大豆蛋白經(jīng)生物酶處理后其溶解性、鮮味特性、消化特性等得以顯著提升的原因。

圖3 大豆低聚肽樣品的多肽長度分布特性

2.3 不同批次間樣品的多肽集合分析

由圖4可知，不同批次樣品間存在共性多肽101條，其中長肽10條，短肽91條。與此同時(shí)，每個(gè)批次樣品中均有部分肽段無法在其他批次中被檢測到，可能與食源性蛋白質(zhì)酶解過程的重現(xiàn)性和隨機(jī)性有關(guān)，蛋白酶分子與蛋白底物的相遇和結(jié)合在物料反應(yīng)體系中具有一定的隨機(jī)性，酶催化位點(diǎn)的斷裂亦存在一定的概率隨機(jī)性，因此其終產(chǎn)物多肽組成分布可能存在一定差異[19]；也可能與質(zhì)譜檢測過程中色譜峰的漂移和離子抑制等有關(guān)，當(dāng)色譜峰存在漂移時(shí)，其引發(fā)的不同程度的離子抑制可導(dǎo)致多肽質(zhì)譜檢測譜圖出現(xiàn)差異，進(jìn)而導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)差異[20]。此外，在質(zhì)譜母離子轟擊過程中，亦可能因雜離子的干擾導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)差異[21]。目前，消除這些檢測差異仍有待質(zhì)譜技術(shù)和多肽組學(xué)分析方法的進(jìn)一步發(fā)展。但可以肯定的是，不同批次樣品間多肽的組成共性與差異并存。絕對的重現(xiàn)性制備在實(shí)際生產(chǎn)中是不存在的，生產(chǎn)過程中任何一種因素的變化都可能導(dǎo)致產(chǎn)物的多肽組成差異。未來，不斷提升設(shè)備自動(dòng)化程度和重現(xiàn)性操控能力，將是不斷縮小差異提升共性，實(shí)現(xiàn)“求同存異”的關(guān)鍵。值得注意的是，樣品E的獨(dú)有多肽數(shù)量(198)明顯高于其他批次樣品，在一定程度上反映樣品E與其他批次樣品之間可能存在較大差異。

圖4 不同批次間樣品的多肽集合分析

2.4 不同批次低聚肽的PCA主成分分析

對不同批次大豆低聚肽樣品進(jìn)行PCA主成分分析，通過對多維質(zhì)譜數(shù)據(jù)的降維處理[22-23]，將數(shù)據(jù)維度和信息簡化，并通過得分圖中樣品間的距離顯示樣品間差異。圖5中，樣品A～D均集中于得分圖下半部分，基本形成同類聚集，而樣品E與其他樣品相距較遠(yuǎn)，在PC2軸上顯示較大差異，這一現(xiàn)象與圖4中樣品E獨(dú)有多肽數(shù)量差異較大的結(jié)果相一致。二者均提示樣品E有別于其他批次樣品，反映大豆低聚肽的工業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖5 不同批次低聚肽的PCA主成分分析

2.5 高豐度多肽分析

基于圖4中所述5個(gè)批次樣品101條共性多肽進(jìn)行離子抽提和峰面積積分，結(jié)合非標(biāo)定量法對上述多肽的平均相對組成進(jìn)行簡要分析，并對豐度前10多肽進(jìn)行手動(dòng)序列結(jié)構(gòu)確認(rèn)，結(jié)果見表1。由表1可知，豐度前10的多肽大多鏈長較短，長度以2～4居多，但值得注意的是，長肽(SEGGLIE)在相對組成中亦占據(jù)了不小的比值。說明大豆蛋白經(jīng)過深度酶促水解處理后，雖然產(chǎn)生了大量的短肽，但與此同時(shí)，仍有部分長肽得以保留。這些長肽的保留現(xiàn)象可能與酶制劑的作用特性有關(guān)，盡管食品用酶制劑大多為廣譜性粗酶，但酶解過程中酶切位點(diǎn)的識(shí)別和斷裂可能依舊與酶制劑的種類具有一定關(guān)聯(lián)性，不同的酶制劑可能表現(xiàn)出不同的酶切傾向[6]。研究和掌握這些酶的作用傾向及規(guī)律，可為未來活性肽的靶向制備提供關(guān)鍵信息指引。

表1 豐度前10共性多肽

3 結(jié)論

采用肽組學(xué)分析技術(shù)，對不同批次大豆低聚肽樣品中多肽的組成共性與差異展開探討，評價(jià)了大豆低聚肽的工業(yè)制備穩(wěn)定性。不同批次樣品的質(zhì)譜總離子流曲線基本一致，且多肽組學(xué)分析效果相近，每種樣品的多肽鑒定量均為1 000左右，組成均以短肽居多，反映不同批次大豆低聚肽之間具有較好的宏觀一致性。然而，進(jìn)一步的多肽集合分析和PCA分析均提示第5批次樣品與其他樣品間多肽組成差異較大，反映目前大豆低聚肽的工業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步加強(qiáng)。相同工藝條件下，不同批次間原料的多肽組成整體表現(xiàn)為共性與差異并存，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)控以逐步縮小差異增強(qiáng)共性，進(jìn)而提升工業(yè)制備的穩(wěn)定性。未來，在宏觀質(zhì)控的基礎(chǔ)上，利用高豐度共性多肽對原料進(jìn)行精準(zhǔn)微觀質(zhì)控，將是多肽質(zhì)量研究的重要發(fā)展方向之一。