胎盤血管生成異常致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)及其中醫(yī)藥治療的研究進展*

姚偉潔，馮 欣

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院，北京 100006

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠的常見并發(fā)癥之一，我國通常將妊娠28周前3次及以上胎兒丟失稱為RSA，其發(fā)生率為15%～25%，且復(fù)發(fā)風險隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升。RSA的病因復(fù)雜，妊娠12周以前RSA的病因多為遺傳因素、內(nèi)分泌異常、生殖免疫功能紊亂及血栓前狀態(tài)等，12周至28周出現(xiàn)RSA主要為血栓前狀態(tài)、感染、妊娠附屬物異常和嚴重的先天性異常等［1］。目前針對RSA的治療主要通過手術(shù)糾正子宮解剖結(jié)構(gòu)異常，通過葉酸、肝素及阿司匹林等藥物改善母體高凝狀態(tài)，或通過誘導(dǎo)產(chǎn)生封閉抗體從而抑制母嬰間的免疫排斥。

有研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細胞功能缺陷導(dǎo)致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一，通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲來促進胎盤血管生成，可以作為治療RSA有效方法之一［2］。血管生成因子和微小核糖核酸（Micro RNA， miRNA）是影響血管生成的關(guān)鍵因素。此外有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有重要的血管生成調(diào)控作用［3］，外泌體能夠?qū)⑿攀购颂呛怂幔╩essenger RNA，mRNA）、miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)傳遞給受體細胞，進行細胞間的通訊，從而改善血管生成以維持正常妊娠。

中藥治療RSA具有獨特優(yōu)勢，而且取得了較好療效，其現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方能通過調(diào)控血管生成而對RSA發(fā)揮治療作用。本文對影響RSA胎盤血管生成的血管生成因子、miRNA以及外泌體在血管生成中的調(diào)控作用進行綜述，并闡述中藥復(fù)方通過調(diào)控血管生成治療RSA的現(xiàn)狀，為中藥復(fù)方治療RSA提供新思路。

1 血管生成異常參與了多種疾病的發(fā)生

血管生成異常導(dǎo)致了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮細胞通過增殖、遷移，形成新的血管，并進行血管網(wǎng)絡(luò)的重建，從而為器官提供血液和氧氣，是器官生長和發(fā)育的重要途徑。該過程由多種生長因子和信號傳導(dǎo)途徑控制，且依賴于促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡調(diào)控，當該平衡被打破，則誘發(fā)疾病。血管生成不足會引發(fā)高血壓、動脈粥樣硬化以及心肌缺血等心血管疾病。血管生成過量，則會誘發(fā)腫瘤疾?。?］。ZANG等［5］發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠通過抑制Notch1表達抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，進而抑制胃癌細胞的血管生成而形成血管生成擬態(tài)。HANG等［6］提出姜黃素能夠抑制胃癌細胞來源的間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）成管、遷移和集落形成，并與VEGF有關(guān)。IWASAKI等［7］使用胎盤生長因子（placental growth factor，PlGF）療法，通過促進心肌修復(fù)和血管生成治療缺血性心臟病，取得了良好效果。以上研究結(jié)果表明改善血管生成已成為治療血管生成失衡疾病的重要手段。

2 RSA與血管生成

研究發(fā)現(xiàn)，血管生成參與了妊娠全過程，妊娠成功取決于胎盤能否構(gòu)建良好的血管網(wǎng)絡(luò)以滿足母體與胎兒之間的生理交換［8］。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量的顯著增加，從而為胎兒提供充足的血液和氧氣，有利于胚胎著床與發(fā)育。特別在孕晚期，子宮和臍帶的血流量及血管密度隨著胎兒生長而急劇增加［9］，若血管生成異常，胚胎血供減少，營養(yǎng)供給不足，胚胎無法存活，從而導(dǎo)致流產(chǎn)［10］。王為男等［11］通過免疫組化染色法發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛間質(zhì)內(nèi)血管數(shù)量明顯減少，管腔狹窄，甚至出現(xiàn)血管破裂和血細胞外溢等現(xiàn)象。Abdel-Razik等［12］采用三維多普勒超聲觀察發(fā)現(xiàn)RSA患者子宮動脈血流阻力較高，且子宮內(nèi)膜血流較低。更有學(xué)者以同樣方法證實RSA患者子宮內(nèi)膜血管化程度較正常妊娠女性降低，并提示螺旋動脈數(shù)量不足，顯示患者血管生成與血流灌注受損［13］。以上研究均證明血管生成異常是RSA患者的顯著病理特征，而血管生成的正常進行是成功妊娠的必要前提。因此，改善血管生成成為治療RSA的有效方法之一。

3 血管生成因子和miRNA RSA對胎盤血管生成的影響

3.1 血管生成因子在調(diào)控RSA胎盤血管生成中發(fā)揮重要作用多個促血管生成因子和抗血管生成因子參與了血管生成過程，如VEGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管生成素（Angiopoietin， ANG）蛋白家族和金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）等。血管生成因子通過促進或抑制血管生成誘導(dǎo)疾病發(fā)生?？梢?，調(diào)控血管生成因子可以成為治療血管生成異常的方式。

3.1.1 VEGF VEGF對血管生成發(fā)揮重要的促進作用是參與血管生成過程中的關(guān)鍵蛋白［5，14-15］，有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠過程中胎兒和胎盤組織中均能檢測到VEGF蛋白及其mRNA表達，VEGF通過介導(dǎo)子宮內(nèi)膜組織血管重塑，利于胚胎著床，是重要的生長調(diào)節(jié)因子［16］。而通過檢測RSA患者血清發(fā)現(xiàn)其VEGF含量較正常妊娠女性顯著降低［17］。XU等［18］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，VEGF基因1154G/A（rs1570360）、+936C/T（rs3025039）、634G/C（rs2010963）和583T/C（rs3025020）多態(tài)性與RSA易感性有關(guān)。

VEGF主要通過調(diào)控VEGFR-1和VEGFR-2酪氨酸受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除VEGFR-1會導(dǎo)致胎盤血管生成障礙，從而導(dǎo)致流產(chǎn)［9］。sVEGFR-1為VEGF的可溶性受體，又稱為可溶性fms樣酪氨酸激酶（soluble FMS-related tyrosine kinase 1，sFLT-1），它可以與VEGF的膜受體競爭結(jié)合VEGF，從而抑制VEGF誘導(dǎo)血管生成的生物學(xué)活性，是VEGF的有效拮抗劑［19］。VEGF通過與VEGFR-2結(jié)合，促使VEGFR-2發(fā)生二聚化和自磷酸化而激活，進而對下游信號通路發(fā)揮激活作用，促進血管生成［20-21］。除了在胎盤血管生成中的作用外，VEGF還參與胎盤血流量調(diào)節(jié)。BOGIC等［22］通過超微結(jié)構(gòu)觀察和熒光染色發(fā)現(xiàn)，VEGF存在于羊胎盤的母體和胎兒血管中，且VEGF在妊娠期間可改善膜內(nèi)血管的分布和通透性。

3.1.2 FGFs FGFs在體內(nèi)和體外均是有效的血管生成因子。FGF可刺激子宮動脈和胎兒胎盤動脈內(nèi)皮細胞增殖，促進血管生成，提高多種細胞類型的細胞存活率［23］。唐雪蓮等［24］通過12例人早孕絨毛離體組織及16例RSA絨毛體外分離培養(yǎng)，消化分離出細胞后，加入FGF進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)FGF能夠促進絨毛滋養(yǎng)層細胞生長。

3.1.3 ANG蛋白家族 ANG蛋白家族也被證明是重要的血管生成因子，對血管生成具有調(diào)節(jié)作用，包括ANG1、ANG2、ANG3、ANG4和酪氨酸激酶受體1和2（Tie1和Tie2）。ANG蛋白家族均可與Tie結(jié)合發(fā)揮對血管生成的調(diào)節(jié)作用，其中ANG1和ANG4能夠通過誘導(dǎo)Tie2的磷酸化促進血管生成，ANG2和ANG3能夠抑制Tie2的磷酸化，從而抑制血管生成［25］。Hess等［26］通過檢測孕鼠模型ANG1含量發(fā)現(xiàn)其ANG1 mRNA表達升高。而LEINONEN等［27］發(fā)現(xiàn)，ANG1或Tie2的缺失可導(dǎo)致孕鼠血管生成障礙，進而造成不良妊娠結(jié)局。楊廷仙［28］通過測定流產(chǎn)患者血清和蛻膜組織ANG1和ANG2發(fā)現(xiàn)二者能夠通過影響血管生成造成流產(chǎn)。

3.1.4 EMMPRIN EMMPRIN在胎盤中同樣被證明具有促血管生成作用。DANG等［29］通過比較未孕、孕中期和孕后期的大鼠發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN有助于上調(diào)子宮和血管中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，促進胎盤發(fā)育早期的螺旋動脈重塑過程。王永清等［30］發(fā)現(xiàn)，孕婦絨毛組織中存在EMMPRIN陽性表達，絨毛內(nèi)滋養(yǎng)層細胞中的EMMPRIN表達隨孕周增加而逐漸加強，通過RNA干擾EMMPRIN的表達能夠抑制滋養(yǎng)細胞侵襲。

3.2 RSA的發(fā)生存在miRNA表達差異，并與胎盤血管生成密切相關(guān)

3.2.1 RSA的發(fā)生存在miRNA表達差異 miRNA是約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。有證據(jù)表明，miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、不育癥和其他生殖系統(tǒng)疾病中起重要作用。DONG等［31］使用人類miRNA芯片分析了RSA患者與正常妊娠婦女的絨毛或蛻膜中miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)RSA患者絨毛中hsa-miR-184、hsa-miR-187和hsa-miR-125b-2的表達較高，而hsa-miR-520f、hsa-miR-3175和hsa-miR-4672的表達低于正常妊娠婦女。且在RSA患者蛻膜中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-517c、hsa-miR-519a-1、hsa-miR-522、hsa-miR-520h和hsa-miR-184表達上調(diào)。通過對差異miRNA進行Gene Ontology（GO）分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析發(fā)現(xiàn)，RSA的發(fā)生與miRNA血管生成有關(guān)。以上研究表明RSA的發(fā)生存在miRNA表達變化，探尋差異miRNA的表達可以作為診斷RSA的標記物，也可為治療RSA提供可能。

3.2.2 miRNA通過影響胎盤血管生成導(dǎo)致RSA miRNA在RSA的血管生成中發(fā)揮了重要作用，ZHU等［32］通過測定RSA患者絨毛和蛻膜組織發(fā)現(xiàn)miR-16表達升高，體外實驗中miR-16的上調(diào)抑制了HUVECs增殖、遷移和血管形成。進一步通過注射miR-16到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)異常的miR-16水平會影響微血管密度及胎盤和胚胎重量，并通過抑制VEGF在懷孕小鼠中的表達而引起RSA。XIA等［33］通過分離流產(chǎn)患者胚胎絨毛組織樣本，證明miR-575在流產(chǎn)孕婦的胎盤中被顯著上調(diào)。進一步通過體外培養(yǎng)人絨毛膜癌細胞JEG-3，并使用miR-575抑制劑進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)血管生成蛋白VEGF表達顯著升高，并有效促進了血管生成。以上研究表明miRNA的變化可通過抑制胎盤血管生成進而導(dǎo)致RSA。

4 外泌體參與了胎盤血管生成，在臨床治療RSA中具有應(yīng)用前景

研究表明，血管生成可以被細胞來源的外泌體調(diào)節(jié)。外泌體是杯狀磷脂雙層囊泡，大小在40～100 nM之間，外泌體的產(chǎn)生源于細胞膜向內(nèi)出芽并形成核內(nèi)體，后期核內(nèi)體限制膜向多泡體（multivesicular bodies，MVBs）內(nèi)侵，MVBs與質(zhì)膜融合釋放出內(nèi)囊泡，即為外泌體［3］。外泌體已經(jīng)被證明可以從多種類型細胞中釋放，其包含基于起源組織的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA，其通過與受體細胞結(jié)合進行細胞間的通訊并影響受體細胞功能［3，34］。

研究發(fā)現(xiàn)，從RSA患者子宮沖洗液和黏液中能夠分離得到外泌體，表明外泌體存在于子宮內(nèi)膜上皮細胞的頂端表面上。通過對子宮內(nèi)膜上皮細胞及其分泌的外泌體進行miRNA分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a含量最高，且與胚胎植入高度相關(guān)［35］。GIACOMINI［36］通過分離人胚胎源外泌體發(fā)現(xiàn)其能夠被子宮內(nèi)膜細胞吸收，表明胚胎和子宮內(nèi)膜能夠通過外泌體進行信息通訊。Komaki則通過培養(yǎng)人足月胎盤組織中的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），并分離培養(yǎng)基中MSCs分泌的外泌體，發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體能夠刺激內(nèi)皮細胞血管生成，表明胎盤中釋放的外泌體具有血管生成的調(diào)節(jié)作用。

外泌體能夠通過攜帶蛋白和miRNA至靶細胞，進而調(diào)節(jié)血管生成。VRIJSEN等［37］通過分離心肌細胞祖細胞中的外泌體，發(fā)現(xiàn)其對內(nèi)皮細胞遷移具有促進作用，進一步分離外泌體得到EMMPRIN，發(fā)現(xiàn)EMMPRIN能夠通過誘導(dǎo)MMP和VEGF表達促進細胞遷移和血管生成。該實驗為臨床治療RSA提供了新思路。通過分離RSA患者血清及蛻膜組織，并提取其中的外泌體，通過測定外泌體中差異蛋白及miRNA表達，可以快速確定RSA發(fā)生的影響因素。甚至通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，從而達到治療RSA的目的。

5 中醫(yī)治療RSA的現(xiàn)狀

5.1 中醫(yī)對RSA病機的認識中醫(yī)認為RSA屬“滑胎”“數(shù)墮胎”及“屢孕屢墮”等范疇，其最早見于隋代《諸病源候論·婦人妊娠諸侯上》，而宋代齊仲甫在《女科百問》一書中首次提出了其臨床特點為“應(yīng)期而下”，并指出可以通過預(yù)服杜仲丸（由杜仲、續(xù)斷組成）預(yù)防滑胎，開創(chuàng)了補腎法治療滑胎的先河［38］。通過對醫(yī)家治療RSA的總結(jié)，普遍認為滑胎主要源于腎虛導(dǎo)致的沖任虛寒，進而引起胎失所養(yǎng)，胎結(jié)不實，屢孕屢墮。腎虛失煦或陰虛生熱會導(dǎo)致血瘀，新血下注胞宮不利，胎失所養(yǎng)，進而導(dǎo)致胎動不安或墮胎［39-40］。因此治療RSA的治則可概括為“溫腎補脾，活血化瘀”，從而達到安胎的治療效果。

5.2 中藥復(fù)方能夠通過改善血管生成治療RSA滋腎育胎丸是羅元愷教授在“壽胎丸”的基礎(chǔ)上加減而成，可用于治療脾腎兩虛、沖任不固所致的胎動不安及滑胎等，其治療RSA的有效率達90%以上。其功效為補腎健脾、益氣培元、養(yǎng)血安胎、強壯身體。儲繼軍等［41］使用CBA/J×DBA/2小鼠構(gòu)建RSA動物模型，通過滋腎育胎丸治療，發(fā)現(xiàn)其能夠降低RSA小鼠的胚胎丟失率，通過提高RSA小鼠體內(nèi)VEGF、VEGFR-2表達改善蛻膜血管新生與重鑄。進一步研究發(fā)現(xiàn)，滋腎育胎丸能夠改善VEGF/PI3K/AKT信號通路，改善蛻膜組織的微血管密度［42］。

補腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其在“壽胎丸”的基礎(chǔ)上加減，并根據(jù)“腎主生殖”“胞胎系于腎”理論形成，可補腎健脾，益氣安胎。研究發(fā)現(xiàn)，其治療妊娠成功率達80%以上，經(jīng)補腎安胎沖劑治療的RSA患者，其血清VEGF水平升高，sFlt-1水平降低，并與促進胎盤絨毛血管形成顯著相關(guān)［43］。進一步研究通過DBA/2×CBA/J小鼠構(gòu)建RSA動物模型，并經(jīng)過補腎安胎沖劑干預(yù)，光鏡及電鏡下觀察到蛻膜組織血管數(shù)量與RSA組相比更加豐富，血管壁及血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)趨于完整［44］。儲繼軍等［32］還發(fā)現(xiàn)補腎安胎沖劑能通過升高RSA小鼠蛻膜組織中的VEGF及VEGFR-2表達，從而改善蛻膜組織的血管重鑄［45］。而李偉莉等［46］研究發(fā)現(xiàn)補腎安胎沖劑可以通過上調(diào)RSA小鼠蛻膜組織中TGF-β1/PI3K/Akt信號通路，進而促進RSA小鼠母胎界面血管生成。郝樂樂［47］研究發(fā)現(xiàn)補腎安胎沖劑可通過激活VHL/HIF-1α信號通路從而間接啟動VEGF通路，促進血管生成。

養(yǎng)血安胎方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院李恩堂先生的經(jīng)驗方，目前已在臨床應(yīng)用30余年，其保胎成功率達98.2%，獲子率為98.0%［48］，可補腎健脾，養(yǎng)血安胎。武穎等［49-50］通過建立腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型對該方進行了更深入研究，并使用養(yǎng)血安胎方進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該方能夠通過調(diào)控TGF-β/Smad通路促進子宮內(nèi)膜VEGF表達，從而調(diào)節(jié)胎盤植入，且療效與劑量成正相關(guān)。

此外，黨慧敏等［51］研究發(fā)現(xiàn)補腎活血方聯(lián)合地屈孕酮片能夠明顯上調(diào)RSA患者血清中VEGF表達水平，從而促進胎盤血管生成以維持妊娠。馮延紅等［52］通過安胎止血方聯(lián)合西藥治療RSA患者，發(fā)現(xiàn)患者血清中胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）、Ang-2水平均較治療前升高，從而促進血管生成，提高妊娠成功率。楊秀芳等［53］研究發(fā)現(xiàn)補腎益氣養(yǎng)血方聯(lián)合西藥治療RSA，有助于升高患者PLGF和Ang-2水平，提高妊娠成功率。

6 總結(jié)

越來越多的證據(jù)顯示，RSA的發(fā)生與血管生成障礙有關(guān)，血管生成因子和miRNA作為影響血管生成的關(guān)鍵因素，越來越受到研究者的重視。血管生成因子具有促進或抑制血管生成的作用，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。通過激動促血管生成因子表達，可以促進血管生成，進而改善RSA。miRNA作為近年的研究熱點，其血管生成調(diào)節(jié)作用在多種疾病中都得到了驗證，在RSA患者中，miRNA可通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子抑制血管生成，導(dǎo)致RSA的發(fā)生。而外泌體作為胎盤與母體間進行交流的通訊形式，能夠通過攜帶蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA至受體細胞，進而影響受體細胞的功能。通過分離RSA患者的血清及蛻膜組織中的外泌體，并測定外泌體中差異蛋白及miRNA的表達，可以快速確定影響RSA發(fā)生的蛋白及miRNA。而通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，也可作為治療RSA的有效方法之一。

中藥復(fù)方治療RSA一般以補腎活血為治則，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方治療RSA多通過調(diào)節(jié)血管生成因子來促進血管生成，從而改善妊娠成功率。然而，由于復(fù)方成分復(fù)雜，中藥的治療作用往往是多靶點的，至今尚未發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方通過調(diào)節(jié)外泌體，進而調(diào)節(jié)外泌體中的蛋白及miRNA的相關(guān)報道，因此，該領(lǐng)域具有重大研究前景。