棉花與模式植物DGAT2基因的鑒定與分析

張曉瓊++喬琳++胡利宗++廖立冰++王秋霞++解恒昌++周琳

摘要：二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（DGAT2）是催化三酰甘油生物合成的關(guān)鍵酶，利用生物信息學(xué)手段在二倍體棉花和6種模式植物中共鑒定出25個(gè)DGAT2基因，詳細(xì)剖析這些基因的結(jié)構(gòu)、序列和進(jìn)化特征?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，絕大多數(shù)植物包含8個(gè)或9個(gè)外顯子，且內(nèi)含子相位高度保守，說明該基因結(jié)構(gòu)起源于陸生植物。蛋白序列分析顯示，核心保守基序1、2、3與功能結(jié)構(gòu)域相互重疊，說明功能結(jié)構(gòu)域起源于藻類植物。進(jìn)化分析顯示：在棉花中，DGAT2基因發(fā)生特異性擴(kuò)增，其分子機(jī)制為串聯(lián)重復(fù)；結(jié)合滑動(dòng)窗口方法和位點(diǎn)模型選擇壓力檢測結(jié)果，DGAT2蛋白均受制于負(fù)選擇作用。這些結(jié)果為棉花及模式植物DGAT2的功能研究提供幫助。

關(guān)鍵詞：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶；保守基序；棉花；模式植物；進(jìn)化

中圖分類號： S562.03；Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0069-04

收稿日期：2015-08-28

基金項(xiàng)目：周口師范學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（編號：ZKNU2014109）；周口師范學(xué)院大學(xué)生科研創(chuàng)新基金（編號：ZKNUD15037）。

作者簡介：張曉瓊（1991—），女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事植物遺傳學(xué)研究。E-mail：zxqxiaoqiong00@163.com。

通信作者：胡利宗，博士，副教授，主要從事植物遺傳學(xué)研究。E-mail：hulizong@126.com。二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT，EC 2.3.1.20）是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步的關(guān)鍵酶[1]。目前，在植物中存在3種類型的DGAT，即DGAT1、DGAT2和DGAT3[2]。前人研究表明，DGAT1、DGAT2和DGAT3隸屬于不同基因家族，其蛋白序列相似性極低，但三者均具有二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性，過表達(dá)這些基因均可不同程度提高植物種子含油量[3]。前人研究顯示，DGAT酶參與種子油脂合成、種子萌發(fā)與發(fā)育以及幼苗發(fā)育等眾多生物學(xué)過程，具有多樣化的功能[4]。自Lardizabal等成功克隆MrDGAT2基因以來，在人類、擬南芥和藻類等物種中均克隆出DGAT2基因[5-7]。DGAT2基因功能研究顯示，DGAT2基因具有底物特異性，優(yōu)先利用特殊脂肪酸進(jìn)行三酰甘油合成[8]。因此，DGAT2基因的相關(guān)研究越來越受到人們的重視。棉花不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，還是天然纖維與油料作物。雖然在棉花纖維發(fā)育、纖維品質(zhì)以及抗逆性等方面開展了許多研究，但棉花DGAT2基因的研究仍未見報(bào)道。此外，二倍體雷蒙德氏棉[9]和亞洲棉[10]全基因組序列測定已經(jīng)被完成，這為在棉花中研究DGAT2基因提供了數(shù)據(jù)資源。利用生物信息學(xué)手段鑒定棉花DGAT2基因，并剖析這些基因的結(jié)構(gòu)、保守基序、功能結(jié)構(gòu)域以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。這些結(jié)果能為闡明棉花油脂積累的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究棉花DGAT2基因的功能提供線索。

1材料與方法

1.1物種抽樣與基因序列下載

本研究涉及的物種包括亞洲棉、雷蒙德氏棉和其他6種模式植物。序列下載步驟為：在NCBI數(shù)據(jù)庫直接檢索并下載已知的DGAT2基因序列，以這些序列為檢索序列，利用BLAST工具在默認(rèn)參數(shù)條件下分別搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫CottonGen（http：//www.cottongen.org/）、Greenphyl V4（http：//www.greenphyl.org/cgi-bin/index.cgi）和Phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net/），最終獲取棉花及其他模式植物的DGAT2基因。并利用Pfam工具[11]確定這些基因是否含有DAGAT（PF03982）。

1.2序列特征與蛋白特性分析

通過DNA和cDNA的比較，棉花與模式植物DGAT2基因外顯子和內(nèi)含子的組織結(jié)構(gòu)模式被鑒定，由GSDS 2.0工具繪制[12]。MEME服務(wù)器被用于剖析棉花與模式植物DGAT2蛋白的保守基序組成模式，參數(shù)設(shè)置如下：保守基序氨基酸長度為6～180 bp；保守基序數(shù)目最大值為10；E閾值為 0.000 01，其他參數(shù)默認(rèn)[13]。此外，利用HMMTOP工具剖析DGAT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)目與位置[14]。

1.3系統(tǒng)進(jìn)化與選擇壓力檢測

為闡明DGAT2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用Clustal X軟件[15]在默認(rèn)條件下對DGAT2蛋白進(jìn)行序列比對，其比對結(jié)果直接導(dǎo)入MEGA軟件[16]中，輸出進(jìn)化樹并進(jìn)行細(xì)微調(diào)整。在進(jìn)化樹的末端，可鑒定出同源基因?qū)?，同時(shí)基于滑動(dòng)窗口方法剖析同源基因?qū)Φ倪x擇壓力，其計(jì)算由DnaSP 5.10完成，參數(shù)設(shè)置為：滑動(dòng)窗口100 bp和步長10 bp[17]。此外，利用Pal2nal工具準(zhǔn)備所有DGAT2基因的密碼子比對序列[18]，利用位點(diǎn)特異模型對DGAT2基因進(jìn)行選擇壓力分析，其計(jì)算過程由PAML 3.15軟件包中的CODEML程序完成[19]。

2結(jié)果與分析

2.1棉花與模式植物DGAT2鑒定與蛋白序列特征

利用Blast工具在2種棉花與6種模式植物中共鑒定出25個(gè)DGAT2基因，這些基因的位點(diǎn)標(biāo)識符、染色體、正負(fù)鏈位置以及基因組匹配區(qū)段均被列出（表1）。功能結(jié)構(gòu)域分析表明，DGAT2基因編碼的蛋白均具有典型的功能結(jié)構(gòu)域DAGAT（PF03982）。聚類分析顯示，2種棉花DGAT2與擬南芥和水稻DGAT2聚在一起形成了一個(gè)雙子葉植物類群；低等植物DGAT2傾向于聚為一類，但有些低等植物DGAT2蛋白單獨(dú)形成一個(gè)分支（圖1-A）。此外，利用HMMTOP工具分析DGAT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，除PaDGAT2c外，棉花與模式植物DGAT2蛋白均具有至少1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（表1）。

利用MEME軟件對DGAT2蛋白的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在25個(gè)棉花和模式植物DGAT2蛋白中存在10個(gè)保守基序（Motif1～10），共形成13種保守基序組織模式，其中6個(gè)棉花DGAT2蛋白共享的保守基序組成模式為 Motif4-6-2-1-3，而AtDGAT2、OsDGAT2a/b和PpDGAT2d等共享的保守基序模式為Motif9-6-2-1-3（圖1-B）。就單個(gè)保守基序而言，所有DGAT2蛋白保守基序被分為兩大類型，即種屬普遍類型和種屬特異類型。保守基序1、2、3、6、9幾乎存在于所有DGAT2蛋白中，屬于種屬普遍類型；但保守基序4、5、7、8、10表現(xiàn)出不同程度的種屬特異性，屬于種屬特異類型。此外，DGAT2蛋白的DAGAT（PF03982） 功能結(jié)構(gòu)域與保守基序1、2、3、6、9相互重疊，這說明植物的5個(gè)保守基序均可能與DGAT2活性高度相關(guān)。

2.2棉花與模式植物DGAT2基因的外顯子與內(nèi)含子組成模式

通過比較DNA與CDS序列，棉花與模式植物DGAT2基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均被闡明，并鑒定其內(nèi)含子相位。根據(jù)外顯子數(shù)目，這些DGAT2基因結(jié)構(gòu)被分為三大類型：（1）8個(gè)外顯子類型，這種類型的基因包括GrDGAT2a、GrDGAT2d和AtDGAT2等5個(gè)基因；（2）9個(gè)外顯子類型，這種類型的基因包括GrDGAT2b、GaDGAT2a和OsDGAT2a等11個(gè)基因；（3）2、3、5、6、7、13個(gè)或14個(gè)外顯子類型，這類基因包括CrDGAT2a、PpDGAT2b和PaDGAT2c等9個(gè)基因（圖1-C）。結(jié)合DGAT2蛋白聚類結(jié)果可知，位于同一進(jìn)化分支的基因往往具有相同或相似的基因結(jié)構(gòu)，甚至外顯子和內(nèi)含子長度、內(nèi)含子相位具有高度保守性；棉花DGAT2蛋白聚為一類，具有高度相似的基因結(jié)構(gòu)，并且這些基因的內(nèi)含子相位高度保守；此外，有些物種DGAT2蛋白單獨(dú)形成一個(gè)分支，具有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)如PaDGAT2d、CrDGAT2a和PaDGAT2b，它們分別擁有2、6、5個(gè)外顯子，并且其內(nèi)含子相位變異較大?？傊?，棉花與模式植物DGAT2基因的結(jié)構(gòu)多數(shù)以8個(gè)或9個(gè)外顯子形式存在，尤其是在高等植物中該基因的結(jié)構(gòu)具有較高的保守性。

2.3棉花與模式植物DGAT2基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

在構(gòu)建棉花與模式植物DGAT2基因的進(jìn)化樹前，移走覆蓋度低于80%、相似度低于30%的序列，進(jìn)而構(gòu)建由亞洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8種植物的14個(gè)DGAT2蛋白形成的進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，藻類植物CrDGAT2a蛋白單獨(dú)形成1個(gè)進(jìn)化分支，與其他植物具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；其他苔蘚類、蕨類、裸子與被子植物DGAT2蛋白明顯被分為2個(gè)進(jìn)化分支，其中被子植物DGAT2蛋白形成1個(gè)進(jìn)化分支，蘚類、蕨類和裸子植物DGAT2形成另一個(gè)進(jìn)化分支（圖2）。此外，在進(jìn)化樹末端分支上，存在4對同源基因，其中2對屬于直系同源基因，2對屬于旁系同源基因；旁系同源基因包括GaDGAT2b/GaDGAT2c和OsDGAT2a/OsDGAT2b，它們起源于物種特異的基因擴(kuò)增；直系同源基因包括GrDGAT2c/GaDGAT2d和GaDGAT2a/GrDGAT2d，它們起源于物種分化事件（圖2）。

2.4基于同源對水平的棉花與模式植物DGAT2基因的選擇壓力

為考察進(jìn)化樹末端的4對同源基因之間是否經(jīng)歷適應(yīng)性進(jìn)化，本研究利用DnaSP 5.10軟件對4對DGAT2同源基因進(jìn)行滑動(dòng)窗口分析，參數(shù)設(shè)置：窗口尺寸為100 bp，步移長度為10 bp。結(jié)果顯示，4對同源基因的ω平均值從大到小為044（GrDGAT2d/GaDGAT2a）>0.31（GaDGAT2b/GaDGAT2c）>016（OsDGAT2b/OsDGAT2a）>0.15（GaDGAT2d/GrDGAT2c）。就旁系同源基因而言，亞洲棉旁系基因?qū)aDGAT2b/GaDGAT2c和水稻旁系同源基因?qū)sDGAT2b/OsDGAT2a的每個(gè)步移窗口對應(yīng)的進(jìn)化速率具有異質(zhì)性，但所有的步移窗口的ω值均小于1，這充分說明這2對旁系同源基因均受控于負(fù)選擇作用，也揭示了基因重復(fù)之后并未發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化（圖3-A）。同理，在2種棉花物種中，直系同源基因?qū)rDGAT2d/GaDGAT2a 和GaDGAT2d/GrDGAT2c的ω均不大于1，這說明物種分化產(chǎn)生重復(fù)基因受到負(fù)選擇作用，這可能與功能限制密切相關(guān)（圖3-B）。

2.5基于類群水平的棉花與模式植物DGAT2基因的選擇壓力

以亞洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8種植物的14個(gè)DGAT2基因?yàn)檠芯繉ο?，利用位點(diǎn)模型對DGAT2基因進(jìn)行選擇壓力檢測，鑒定出正選擇位點(diǎn)，并利用貝葉斯后驗(yàn)概率推斷每個(gè)正選擇位點(diǎn)概率值。似然比檢驗(yàn)表明，2ΔlnL=271.62>13277（M0/M3），這說明M3極顯著優(yōu)于M0（P<0.01），因此，這些DGAT2蛋白位點(diǎn)間的進(jìn)化速率明顯具有異質(zhì)性；就M2a和M1a比較而言，似然比檢驗(yàn)值2ΔlnL=0<5.991，說明M2a并不優(yōu)于M1a模型，DGAT2基因可能未經(jīng)歷適應(yīng)性進(jìn)化；同理，2ΔlnL=0<5.991（M7/M8），說明M8模型并不優(yōu)于M7模型，進(jìn)而可推知棉花與模式植物DGAT2基因中并沒有鑒定到正選擇氨基酸位點(diǎn)（表2）。結(jié)合似然比測驗(yàn)和貝葉斯推斷分析可知，棉花與模式植物DGAT2基因均受制于負(fù)選擇作用，這意味著DGAT2具有高度保守性，這可能與嚴(yán)格的功能限制相關(guān)。

3結(jié)論與討論

DGAT2基因廣泛存在于真菌、藻類、植物和動(dòng)物基因組中，尤其是在藻類植物中通常以多拷貝形式存在[1，3，20-21]，這說明DGAT2基因起源較早，是一個(gè)古老的基因家族。與藻類植物相比，被子植物中DGAT2基因數(shù)目較少，絕大多數(shù)物種僅包括1個(gè)或2個(gè)成員。但令人感興趣的是，在2種二倍體棉花中均發(fā)現(xiàn)了4個(gè)DGAT2基因，并且在2種二倍體棉花中DGAT2基因均以串聯(lián)重復(fù)方式排列在同一個(gè)染色體區(qū)段內(nèi)，這說明棉花DGAT2基因發(fā)生了物種特異性串聯(lián)重復(fù)?；蚪Y(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析顯示，所有物種DGAT2序列特征具有較高的多樣性，但在被子植物中DGAT2基因的結(jié)構(gòu)與蛋白基序均表現(xiàn)出高度保守性，這說明被子植物DGAT2蛋白受到嚴(yán)格的功能限制，具有高度相似的生物學(xué)功能，這與前人的研究結(jié)果[21-22]基本一致。此外，水稻和棉花的DGAT2同源基因?qū)x擇壓力檢測顯示，同源基因?qū)Ψ只蟛]有發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化。同時(shí)，基于位點(diǎn)模型對DGAT2蛋白進(jìn)行選擇壓力分析，結(jié)果表明植物的14個(gè)DGAT2蛋白均受控于負(fù)選擇作用，受到嚴(yán)格的功能限制作用[21]?？傊?，二倍體棉花基因組中存在4個(gè)DGAT2基因，這些基因呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)特征，并且棉花DGAT2基因受純凈選擇作用，這與其功能重要性密切相關(guān)。這些結(jié)果揭示了DGAT2基因的序列特征與進(jìn)化關(guān)系，為其功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

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