金麗瓊,張 睿,劉 妤,楊 靜
(甘肅省分析測(cè)試中心,甘肅蘭州 730000)
己烯雌酚是添加在飼料中促進(jìn)魚類的生長屬激素類藥物,因此被作為飼料添加劑而廣泛使用。隨著人們對(duì)食品安全的重視,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中的己烯雌酚殘留物會(huì)導(dǎo)致生物機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異?;虍a(chǎn)生腫瘤等危害,是一種致癌物質(zhì)[1-2]。由于生物富集作用,大量使用激素藥物,對(duì)環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此國內(nèi)外開始在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中將己烯雌酚列為禁用品,2002年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布176號(hào)公告禁止在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用己烯雌酚[3],綠色食品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水產(chǎn)品中要求己烯雌酚不得檢出[4]。
目前水產(chǎn)品中己烯雌酚的檢測(cè)方法有:①農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-1—2009《動(dòng)物性食品中己烯雌酚殘留檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法》[5],該方法檢出限為2 μg/kg,己烯雌酚的添加濃度水平在3~12 μg/kg時(shí),回收率為60%~110%;②行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3020—2004《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的測(cè)定 酶聯(lián)免疫法》[6],該方法檢出限為0.6 μg/kg,回收率≥70%;③農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-9—2009《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量檢測(cè) 氣相色譜-質(zhì)譜法》[7],該方法檢出限為0.5 μg/kg,己烯雌酚的添加濃度為0.5~10.0 μg/kg時(shí),回收率≥70%。己烯雌酚沸點(diǎn)為407 ℃,超出了色譜柱的使用溫度上限(325 ℃),并且由于己烯雌酚極性較大,會(huì)吸附在色譜柱上,對(duì)色譜柱有一定的損害,因此需要將己烯雌酚衍生化生成低極性、易氣化的硅烷化衍生物[8],再用GC-MS/MS檢測(cè),因此衍生化的效果直接影響檢測(cè)結(jié)果。目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中己烯雌酚的檢測(cè)方法以氣相色譜-質(zhì)譜法為主,因此該試驗(yàn)通過對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中己烯雌酚衍生條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化,簡(jiǎn)化前處理過程,減少有機(jī)試劑的污染,建立水產(chǎn)品中己烯雌酚的快速、綠色的檢測(cè)方法。
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1試驗(yàn)樣品。鱒魚樣品,超市購買。
1.1.2試劑。甲醇、正己烷、吡啶、乙腈、乙酸乙酯,色譜級(jí),瑞典歐普森公司;無水乙醚、無水碳酸鈉,分析純,上海國藥集團(tuán);衍生化試劑N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)體積比99∶1,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/mL),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。SLH固相萃取柱,500 mg,6 mL。
1.1.3主要儀器。賽默飛三重四級(jí)桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,TSQ Quantum XLS,離子源類型為EI,美國Thermo Fisher Scientific 公司;電子天平,ME2002/02型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;恒溫氮吹裝儀,JRA-12YW型,無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司;樣品瓶,2 mL,美國Thermo Fisher Scientific公司。渦旋混合器,MX-S型,美國塞洛捷克公司;高速冷凍離心機(jī),湘儀H-2050R型,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,RE100-Pro,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司;固相萃取裝置,57101-U,美國SUPELCO公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1樣品前處理過程。取水產(chǎn)品可食用部分充分勻漿→稱取樣品→有機(jī)試劑提取→40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干→有機(jī)試劑溶解→固相萃取小柱凈化→衍生化試劑衍生后上機(jī)待測(cè)。
1.2.2樣品的提取與凈化。50 mL離心管中稱取5 g試樣(精確到0.01 g),加入乙酸乙酯20 mL,渦旋1 min后7 000 r/min 離心10 min。取上層乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中,再加入15 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次,合并2次乙酸乙酯提取液。40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用1 mL正己烷溶液溶解殘留物,待凈化。
依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化SLH固相萃取柱,取備用液過柱,依次用2 mL正己烷、2 mL乙酸乙酯溶液淋洗小柱,棄淋洗液,將固相萃取柱抽干,依次用10 mL正己烷、乙酸乙酯洗脫,收集于50 mL離心管,40 ℃水浴氮吹干。用1.0 mL正己烷溶解殘留物,轉(zhuǎn)移至樣品瓶中,氮?dú)獯蹈?,?.0 mL正己烷復(fù)溶,待衍生[9]。
1.2.3衍生化條件的單因素試驗(yàn)。樣品經(jīng)過提取、凈化后,在樣品瓶中加入衍生化試劑N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)(體積比99∶1),渦旋混勻,在一定溫度下進(jìn)行衍生化,再氮?dú)獯蹈?,?.0 mL正己烷定容,用氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)分析。
在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法和前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,稱取5 g試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞塑料離心管中,分別以乙酸乙酯為提取試劑,選取SLH固相萃取小柱凈化樣品,衍生化試劑添加量40、50、60、70、80、90、100 μL,衍生化溫度40、50、60、70、80、90、100 ℃,衍生化時(shí)間10、20、30、40、50、60、70 min,進(jìn)行單因素試驗(yàn),研究這3個(gè)因素對(duì)水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的提取效率的影響,均設(shè)置3個(gè)平行。
1.2.4衍生化條件的正交試驗(yàn)。以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選取衍生化試劑添加量、衍生化溫度、衍生化時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,研究這些因素對(duì)水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的提取效率的影響,均設(shè)置3個(gè)平行。
1.2.5氣相色譜-質(zhì)譜條件。色譜柱型號(hào)為Thermo TR-PESTICIDE Ⅱ(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持1.5 min,以25 ℃/min上升至90 ℃保持1.5 min, 以25 ℃/min上升至180 ℃保持1.5 min,然后以5 ℃/min上升至280 ℃,最后以10 ℃/min上升至300 ℃保持5 min。進(jìn)樣口溫度270 ℃;載氣為高純氦氣(99.999%);流速1.2 mL/min;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣;溶劑延遲4.00 min。離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度280 ℃;掃描方式為選擇離子模式(SIM);己烯雌酚正反式衍生物監(jiān)控離子(m/z)383、397、412、413。己烯雌酚衍生物EI離子源總離子流圖和質(zhì)譜圖見圖1。
圖1 己烯雌酚衍生物EI離子源總離子流圖(a)和質(zhì)譜圖(b)Fig.1 Total ion current diagram (a) and mass spectrum diagram (b) of diethylstilbestrol derivative EI ion source
1.2.6方法線性考察。取己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品,用衍生化試劑衍生后,上機(jī)檢測(cè),建立0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線,結(jié)果顯示(圖2),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.2~1.0 μg/mL呈良好的線性關(guān)系(R2>0.991 5)。
圖2 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of diethylstilbestrol
2.1 衍生化條件的單因素試驗(yàn)
2.1.1衍生化試劑添加量對(duì)衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變,在衍生化溫度為80 ℃、衍生化時(shí)間為30 min的條件下,不同的衍生化試劑添加量對(duì)回收率的影響見圖3。從圖3可以看出,隨著衍生化試劑添加量增加,衍生化效率提高,但是添加量超過80 μL后,衍生化效果趨于平緩。因此最佳衍生化試劑添加量為80 μL,正交試驗(yàn)的衍生化試劑添加量確定在70、80、90 μL。
圖3 衍生化試劑添加量對(duì)衍生化效率的影響Fig.3 Effect of addition amount of derivatization reagent on derivatization efficiency
2.1.2衍生化溫度對(duì)衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變,在衍生化試劑添加量為80 μL、衍生化時(shí)間為30 min的條件下,不同的衍生化溫度對(duì)回收率的影響見圖4。從圖4可以看出,在40~80 ℃時(shí)隨著衍生化溫度的升高,衍生化效果有明顯提高,但是80 ℃以后,隨著溫度的升高,衍生化效果反而下降。因此最佳衍生化溫度為80 ℃,正交試驗(yàn)的衍生化溫度確定在60、70、80 ℃。
圖4 衍生化溫度對(duì)衍生化效率的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature on derivatization efficiency
2.1.3衍生化時(shí)間對(duì)衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變,在衍生化溫度為80 ℃、衍生化試劑添加量為80 μL的條件下,不同的衍生化時(shí)間對(duì)回收率的影響見圖5。從圖5可以看出,隨著衍生化時(shí)間的延長,衍生化效果明顯提高,超過30 min以后,影響不再顯著,因此為了節(jié)省樣品檢測(cè)時(shí)間,最佳衍生化時(shí)間為30 min,將正交試驗(yàn)的時(shí)間確定在10、20、30 min。
圖5 衍生化時(shí)間對(duì)衍生化效率的影響Fig.5 Effect of derivatization time on derivatization efficiency
2.2 衍生化條件的正交試驗(yàn)從表1可以看出,影響衍生化效果的各因素主次為A>B>C,即衍生化時(shí)間對(duì)衍生化效果的影響最大,其次是衍生化溫度,衍生化試劑添加量的影響最小。方差分析結(jié)果表明,因素A的P<0.01,R值大于其他2個(gè)因素,說明衍生化時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著;因素B的P<0.05,即衍生化溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著。按照各因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小,最終確定的最優(yōu)工藝條件是A3B3C1,即衍生化時(shí)間為30 min,衍生化試劑添加量為70 μL,衍生化溫度為80 ℃。
表1 正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3 方法的靈敏度在空白樣品中己烯雌酚為未檢出的前提下,取濃度為0.01 μg/mL己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μL,添加到5 g的樣品中,經(jīng)過樣品前處理過程后測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該方法的定量限為0.5 μg/kg。
2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度根據(jù)我國現(xiàn)行的相關(guān)法律法規(guī),在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中不允許使用己烯雌酚,因此在水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量是不得檢出,現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中定量限為0.5 μg/kg。對(duì)鱒魚樣品分別添加濃度為0.5、5.0、10.0 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添標(biāo)回收率試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2),回收率在70.6%~92.7%,滿足試驗(yàn)要求[10]。
截至目前,水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和氣相色譜-質(zhì)譜法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法主要應(yīng)用于大批量的陽性樣品的篩查,檢測(cè)出陽性樣品時(shí)還需要用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)一步確認(rèn)。因此參考現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法和單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,選用乙酸乙酯進(jìn)行提取,SLH固相萃取小柱,進(jìn)行樣品凈化;以簡(jiǎn)化前處理過程和減少有機(jī)試劑的使用為目的,通過正交試驗(yàn)得到較優(yōu)的己烯雌酚衍生化試驗(yàn)的條件,即衍生化試劑添加量為70 μL,衍生化溫度為80 ℃,衍生化時(shí)間為30 min。