交叉引物擴增法檢測食品中大腸桿菌不耐熱腸毒素的探討

李 偉，任重杰

（鄆城縣檢驗檢測中心，山東菏澤 274700）

近年來，由于食品行業(yè)的迅速發(fā)展，食源性致病微生物引發(fā)的食物中毒、食源性疾病的發(fā)生率不斷增加，給人們的健康和生活帶來極大的威脅，同時也給我國的公共健康和經(jīng)濟帶來了巨大損害。由于食物環(huán)境的原因，大腸桿菌不耐熱腸毒素一直是引起食物中毒的主要原因。因此，快速、靈敏地檢測出大腸桿菌不耐熱腸毒素對食品安全管理具有重要意義。

1 交叉引物擴增法技術(shù)及應(yīng)用

1.1 交叉引物擴增方法概述

交叉引物擴增技術(shù)是一種新的核酸等溫擴增技術(shù)。交叉引物擴增技術(shù)采用一種DNA 聚合酶，在溫度為62 ℃的恒溫下保溫1 h，即可特異、快速、高效地完成核酸的擴增[1]。本技術(shù)與快速檢測技術(shù)（如快速檢測紙條、一次性核酸檢測設(shè)備）的組合，為臨床快速檢測、分子診斷、檢疫和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的檢測方法。

1.2 交叉引物擴增方法特點

交叉引物擴增方法在檢驗檢疫、檢測突發(fā)傳染病和醫(yī)院的早期篩查中得到了廣泛的應(yīng)用。由于CPA 的成本較低，CPA 的擴增只能在離心機和諸如水浴、金屬浴等簡單的恒溫裝置中進行。由于其操作簡單，且對操作者不具備太高的操作水平要求，一般人只要經(jīng)過簡單的訓(xùn)練或自學(xué)就可熟練使用，這為推廣這項技術(shù)創(chuàng)造了良好的條件。該方法具有很好的特異性，能為6 個目標基因區(qū)設(shè)計6 ～8 條特異引物，以確保反應(yīng)的特異性[2]。同時，其靈敏度高，可從少量復(fù)制中分離到目標基因，其敏感性能夠達到10 個拷貝。產(chǎn)品的檢測方法簡單，特異性高，可用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定，也可將熒光染料添加到擴增產(chǎn)品中，根據(jù)顏色的改變來判斷，也可采用一次性的抗污染核酸檢測設(shè)備進行檢測，降低了假陽性的發(fā)生概率。

1.3 交叉引物擴增反應(yīng)原理

CPA 擴增系統(tǒng)主要由置換引物、交叉引物和Bst DNA 聚合酶組成，通過Bst DNA 聚合酶的鏈替換，可實現(xiàn)DNA 的連續(xù)重復(fù)擴增。CPA 的擴增過程包括以下幾個步驟。①生成具有交叉引物位點的擴增產(chǎn)物。PFs 的5’末端和反交引物PRa 的雜交序列是一致的。在交叉引物的前面，排列著替代引物。取代引物的濃度比交叉引物要低。BST DNA 聚合酶可通過替換的方式，在不同的位置上不斷地延伸出不同的交叉引物。固定的前鏈5’末端是由替換引子和交叉引子不斷地擴展而形成的。PFa 也是同樣的原理，它可通過伸展和排列來形成另外一條固定的鏈條[3]。②擴增交叉引物。該排列鏈由末端新生成的引物位點構(gòu)成，并將其3’端交叉引物的導(dǎo)入點模板。利用引物的不斷雜交、延伸以及擴增產(chǎn)物自身的雜交延伸，可形成多個引物雜交，加快擴增進程。③對產(chǎn)品的生成進行檢測。在反應(yīng)完成后，會產(chǎn)生一種單鏈、雙鏈、半雙鏈的混合物。

1.4 交叉引物擴增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測方法

CPA 方法得到的核酸擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為一條帶狀。通過電泳觀察，可判斷是否出現(xiàn)了一個梯度條。可將嵌入的熒光染料（乙溴錠、SYBR Green I）等加入反應(yīng)系統(tǒng)，且根據(jù)反應(yīng)溶液中熒光強度的改變判定產(chǎn)品的生成，從而判定是否有擴增反應(yīng)。若將1 μm SYBR GreenI 型熒光染料加入雙鏈DNA 的小溝中，在產(chǎn)生擴增產(chǎn)物時，可與DNA 雙鏈連接，使熒光染料從橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色[4]。利用一次性的核酸檢測儀和核酸膜色譜快速檢查紙等產(chǎn)品，對顯色試紙進行目視判讀，只在C 質(zhì)控區(qū)處有一條紅線時，判定為陰性，即沒有反應(yīng)；若有兩條紅線，分別在T 檢測區(qū)和C 質(zhì)控區(qū)，判定為陽性，表示有反應(yīng)，若無紅線，則判定為無效。

2 材料與方法

2.1 模板的制備

用麥康凱瓊脂平板37 ℃下培養(yǎng)C83903（LT’）菌株16 ～24 h。用LB 液為載體，在37 ℃下，用200 r·min-1的振蕩試驗研究了該菌的生長特性。將 5 mL 的培養(yǎng)基，在10 000 r·min-1下進行3 min 的離心，將上清液作為DNA 模板，貯存于-20 ℃的無菌環(huán)境下備用。

2.2 生豬肉人工隨機污染

用麥康凱培養(yǎng)基C83903（LT′*）菌株在37 ℃下過夜培養(yǎng)，稀釋1 000 倍后，將其稀釋菌液與無LT毒素的豬肉樣品進行混勻。在10 000 r·min-1的條件下離心3 min 后，將上清液排出，用1 mL 0.9%的生理鹽水進行懸浮培養(yǎng)，再用腸毒素大腸埃希氏菌對樣本進行人工污染，并進行記錄。

2.3 特異性檢測

采用14 個試驗菌（6 個大腸桿菌和8 個非大腸桿菌），將其與LAMP 法進行對比。反應(yīng)完成后，將預(yù)先滴入的SYBR GreenI 型熒光染料與所述擴增產(chǎn)品相混合，在自然和紫外線下進行觀察，使用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行檢測。

2.4 人工污染生豬肉樣本的檢測

采用CPA 法、LAMP 法、qPCR 法，對人工感染經(jīng)產(chǎn)腸毒素的大腸埃希氏菌生豬肉樣本共計50 例進行了檢驗，采用DNA 萃取試劑對豬肉樣品進行處理，以DNA 基因組為模板，以2%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測CPA、LAMP 擴增產(chǎn)物，并與qPCR 進行對比。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測方法的建立與優(yōu)化

該引物的特異性較強， 在60 ℃、60 min 條件下可大量擴增LT 毒素，用2%的瓊脂糖電泳法檢測，其陽性呈不規(guī)則的梯形條紋，而在陰性對照組中無條帶。用華峰管另一頭的SYBR GreenI 染料與反應(yīng)產(chǎn)物進行混合，用肉眼觀察，在正試管中呈綠色，陰性試樣為橙色；在紫外線的作用下，陽性管的熒光呈綠色，而陰性管則不變，如圖1 所示。

圖1 反應(yīng)產(chǎn)物的陰性管與陽性管

通過實驗，對反應(yīng)溫度、Bst 聚合酶、dNTPs、Mg、甜菜堿濃度和擴增時間進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)62 ℃、 64 ℃、66 ℃是最佳的擴增溫度；采用8 U/管Bst 聚合酶法進行擴增，得到的條帶最明顯，最佳的Bst聚合酶濃度是8 U/管；在0.3 mmol·L-1dNTPs 中，dNTPs 的擴增條件最為明顯；實驗結(jié)果表明，在 45 min 內(nèi)，樣品中有一條明顯的階梯狀條紋，但隨著反應(yīng)時間的延長，條帶的亮度沒有顯著的改變，因此45 min 是最佳的擴增時間。按上述原理進行CPA反應(yīng)，最佳Mg 濃度為2.0 mmol·L-1，甜菜堿濃度為 0.8 mol·L-1。

3.2 特異性試驗

采用CPA 法，對14 個不同的細菌進行了特異性測定，并重復(fù)了3 次。用瓊脂糖電泳法測定了2 個帶有LI+基因的菌株，其余12 個是未攜帶LI+基因的菌株，與LAMP 的檢測結(jié)果相吻合，證明了該方法的特異度較高。

3.3 人工污染生豬肉樣本檢測結(jié)果

采用CPA 法和LAMP 法，對50 例無菌感染的豬肉樣品進行了快速檢測。結(jié)果表明，CPA、LAMP法各檢測到7 個帶有LT 的基因，與qPCR 的檢測結(jié)果基本相符，其檢出率為14%。

表1 臨床樣本檢測結(jié)果（n=50）

4 結(jié)論與討論

本文通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、酶濃度、dNTPs 濃度等因素，構(gòu)建了一種快速、特異、靈敏度高的新型CPA探針。與LAMP 法比較，該方法特異性強，從加樣到反應(yīng)結(jié)束，只需1.5 h 就能完成目標基因的特異擴增，而對非攜帶目標基因的鑒定結(jié)果為陰性[5]。本文采用人工污染的生豬肉模擬樣品，采用熒光PCR 技術(shù)，采用CPA、LAMP 法進行人工感染，其陽性檢出率達到14%（7/50），表明CPA 是一種新的檢測技術(shù)，可滿足食品衛(wèi)生領(lǐng)域微生物質(zhì)量檢驗的需要。

CPA 擴增時，由于系統(tǒng)中DNA 的連續(xù)合成，會導(dǎo)致大量的焦磷酸鎂沉淀，因此可通過是否有白色沉淀來判斷，但當(dāng)LT 毒素基因擴增時，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的乳白色沉淀，而用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測，可看到不同尺寸的區(qū)域帶階梯狀結(jié)構(gòu)[6]。為了避免在打開瓶蓋時產(chǎn)生的大量氣溶膠對周圍環(huán)境的影響，本文選擇廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的華峰管進行可視化檢測，將SYBR 綠色I 型染料和反應(yīng)系統(tǒng)的混合液加入華峰管，使二者在反應(yīng)結(jié)束后進行混合，以確定反應(yīng)的效果，有效地防止了氣溶膠所致的交叉污染。

綜上，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是一種非常危險的病原體，會引起食源性疾病，因此建立一種快速、準確的檢測方法，對于保證食物安全和人體的健康非常重要。交叉引物擴增法具有時間短、成本低、特異性高等優(yōu)點，且無需特殊、昂貴的儀器和實驗環(huán)境，為食品致病菌的檢測開辟了一條新途徑。