蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量測定的不確定度評定

黃潔潔，王玲玲，邢薇薇

（安徽省食品藥品檢驗研究院（安徽國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），安徽合肥 230051）

蜂王漿是由工蜂分泌的呈白色或淡黃色漿狀物，含有多種功能因子，其中最受關(guān)注的是10-羧基-2-癸烯酸（10-HDA）。10-HDA 是一種不飽和脂肪酸，由工蜂上顎腺分泌[1]，是蜂王漿所特有的高效生物活性物質(zhì)，因其特殊的藥理和保健作用，受到醫(yī)療領(lǐng)域和保健食品領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[2]。在食品領(lǐng)域，蜂王漿被視為一種天然的保健產(chǎn)品，而10-HDA 是蜂王漿的核心品質(zhì)指標(biāo)，《蜂王漿》（GB 9697——2008）根據(jù)10-HDA 含量要求分為合格品（含量≥1.4%）和優(yōu)等品（含量≥1.8%）兩個等級[3]，即10-HDA 含量越高，蜂王漿品質(zhì)越好。在食品安全監(jiān)管工作中發(fā)現(xiàn)，市售蜂王漿存在摻假摻雜、以次充好現(xiàn)象，品質(zhì)低劣的產(chǎn)品中10-HDA 含量指標(biāo)未達(dá)“合格線”。為維護(hù)食品安全和良好的產(chǎn)品市場秩序，蜂王漿中的10-HDA 含量是國家抽檢蜂王漿類產(chǎn)品的重要監(jiān)測指標(biāo)。因而，評價此類產(chǎn)品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性有重要意義。

測量不確定度是被測量的客觀值在某一量值范圍內(nèi)的評定，不確定度的值越小，表示測量的質(zhì)量越高。其概念在計量基準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中應(yīng)用廣泛，并滲透到更寬廣的測量分析領(lǐng)域。為了更準(zhǔn)確地表達(dá)結(jié)果和質(zhì)量評定，本文依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1——2012）[4]，對蜂王漿中的10-HDA 的不確定度進(jìn)行評定，分析不確定度來源，確保評定結(jié)果質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣為某蜂王漿產(chǎn)品。

10-羥基-2-癸烯酸標(biāo)準(zhǔn)品（10-HDA，阿爾塔公司）；無水乙醇（優(yōu)級純）；對羥基苯甲酸甲酯；甲醇（色譜純）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（島津，配紫外檢測器）；高速離心機(jī)；電子天平（梅特勒）。

1.3 樣品前處理

稱取解凍后的樣品0.5 g，加入0.03 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL、水2 mL，渦旋混合后加入無水乙醇 30 mL，加入對羥基苯甲酸甲酯（內(nèi)標(biāo)，約0.65 mg·mL-1）10 mL，用無水乙醇稀釋并定容至50 mL，超聲15 min后在3 000 r·min-1下離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣[3]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

10-HDA 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：精密稱取25 mg10-HDA 標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇溶解，移入10 mL 容量瓶并定容至刻度，制成濃度為2.5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

10-HDA 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制：分別吸取10-HDA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL 和 2.0 mL至10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙醇定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)測試液。

1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇+水+0.03 mol·L-1鹽酸（55+35+10，v∶v∶v）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：4 μL。

1.6 數(shù)學(xué)模型

試樣中10-HDA 計算公式為

式中：X為10-HDA 的含量，%；F為校正因子；Ai為試樣溶液中10-HDA 峰面積；As為試樣溶液 中內(nèi)標(biāo)物峰面積；ms為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，g；mi為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)檢測過程和數(shù)學(xué)模型，確定該實驗的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入、試樣制備過程引入和試樣測量重復(fù)性引入。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度

10-HDA 標(biāo)準(zhǔn)品購自阿爾塔公司，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書顯示其不確定度為0.5%，采用均勻分布，包含因子k=2，因此，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對不確定度

稱量使用的天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.1 mg，假設(shè)為均勻分布，稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的相對不確定度

（1）容量瓶校準(zhǔn)引入的相對不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196——2006）[5]，10 mL A 級容量瓶允差為±0.020 mL，按矩形分布，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）溫度引入的相對不確定度。乙醇的膨脹系數(shù)為7.5×10-4℃-1，實驗溫度變化范圍為（20±3）℃，按照均勻分布，溫度差異引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的相對不確定度為

2.1.4 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)引入的相對不確定度

在本試驗測定10-HDA 過程中，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品待測液加入的是同一配制的對羥基苯甲酸甲酯內(nèi)標(biāo)液，其純度和配制不影響樣品中10-HDA的含量測定，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)引入的不確定度僅由體積產(chǎn)生，因此其不確定度在標(biāo)準(zhǔn)使用液配制過程中 討論[6]。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制引入的相對不確定度

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制過程產(chǎn)生的不確定度主要由玻璃量具、移液槍所引入，室溫變化影響因素較小，忽略不計，詳見表1。10 mL A 級容量瓶使用5 次，引入的不確定度同2.1.3。

表1 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制過程中移液管、移液槍引入的相對不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)使用液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合上述因素，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本試驗采用5 個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行測量，用HPLC 法測試其峰面積響應(yīng)值，以10-HDA 溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的濃度比值為橫坐標(biāo)x，以10-HDA 溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的峰面積比值為縱坐標(biāo)y，線性回歸方程為y=4.349 08x+0.021 97，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。回歸直線標(biāo)準(zhǔn)偏差按式（2）計算，10-HDA 校準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度按式（3） 計算。

式中：Ai為擬合工作曲線中各點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值；Ci為擬合曲線中各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的濃度，μg·mL-1；b為擬合工作曲線的斜率；a為擬合工作曲線的截距；N為擬合曲線中點(diǎn)的個數(shù)，N=5；SA為擬合工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；p為樣品的測定次數(shù)，p=1；C為樣品濃度，C——為標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的平均值，μg·mL-1。

計算得urel(C)=0.005 95，則標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 試樣制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.1 試樣稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

電子天平檢定證書標(biāo)出的線性誤差為±0.1 mg，假設(shè)為均勻分布，樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 試樣定容體積引入的相對不確定度

50 mL A 級單標(biāo)線容量瓶允差為±0.05 mL，u(V1)=0.000 58；10 mL A 級單標(biāo)線吸量管允差為±0.02 mL，u(V2)=0.001 15；2 mL A 級單標(biāo)線吸量管允差為±0.010 mL，u(V3)=0.002 89。因此，試樣定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，試樣制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 試樣測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

同一操作者對蜂王漿中10-HDA 含量進(jìn)行6 次重復(fù)測定，結(jié)果分別為1.046%、1.041%、1.034%、1.042%、1.039%和1.046%，平均值為1.0413%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S(X)=0.004 6。

2.5 合成不確定度

由上述各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成蜂王漿中10-HDA 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 擴(kuò)展不確定度

按照包含因子k=2（置信水平95%），計算出高效液相色譜法測定蜂王漿中10-HDA 含量的相對擴(kuò)展不確定為urel=k×urel(X)=2×0.019 6=0.032 9，擴(kuò)展不確定度為U=1.041×0.039 2=0.040 8%。

2.7 測量結(jié)果及不確定度的報告

蜂王漿中10-HDA 測定結(jié)果可表示為X=（1.041±0.040 8）%，k=2。

3 結(jié)論

本文采用HPLC 法測定蜂王漿中10-HDA 含量時，通過不同方面的分析，確定不確定度的來源及不確定度分量，發(fā)現(xiàn)主要影響因素為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。依據(jù)本研究結(jié)果，可通過在測定過程中選用精度較好的量器、規(guī)范操作移液管和容量瓶，確保配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的準(zhǔn)確性，通過定期檢定儀器，穩(wěn)定儀器狀態(tài)等方式降低測量的不確 定度。