16S rDNA 鑒定泡椒鳳爪中的腐敗菌

孫玉俠,黃國保

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川成都 611100；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術重點實驗室，廣西玉林 537000）

雞爪富含膠原蛋白，營養(yǎng)價值較高，20 世紀70年代以前主要作為禽肉制品烹飪的下腳料，1978 年后，我國開始進口西方國家肥厚、型大、價廉的雞爪，西南地區(qū)勞動人民以其食物的新鮮麻辣特色為出發(fā)點，創(chuàng)造性地將雞爪與泡椒結(jié)合到一起，制作出具有鮮辣脆嫩風味的泡椒鳳爪。

16S rDNA 分子生物學方法主要通過對微生物染色體上菌種之間差異性特異序列之間的比對鑒別微生物種屬，靈敏度高，是鑒定微生物常用的分子生物學方法。本文選取脹袋變質(zhì)樣品與合格樣品進行對照，分離培養(yǎng)純化兩組樣品中的微生物，根據(jù)傳統(tǒng)細菌菌體菌落形態(tài)，并結(jié)合16S rDNA 法鑒定泡椒鳳爪腐敗微生物，分析引起脹袋的特定腐敗菌，從而為加工過程中微生物污染的靶向精準控制提供科學依據(jù)，延長產(chǎn)品貨架期。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

泡椒鳳爪樣品由重慶市計量質(zhì)量檢測研究院提供。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、EMB 瓊脂培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、CN 選擇性瓊脂培養(yǎng)基、MYP 瓊脂培養(yǎng)基、Barid-Parker 瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術責任有限公司。

細菌基因組提取試劑盒，天根（北京）生化科技有限公司；Mix Ex Taq 寶生物工程（大連）有限公司；PCR 引物的合成以及DNA 序列的測定由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；其余試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐敗菌的分離純化

在無菌操作條件下，分別從合格樣品和變質(zhì)樣品中選取雞爪、泡椒和汁液共25 g，用無菌剪刀剪碎雞爪，加入225 mL 無菌生理鹽水，振蕩1 min，然后取1 mL 上清液進行梯度稀釋，選擇10-1、10-2、10-33 個稀釋度，涂布于不同的選擇性培養(yǎng)基上，合格樣品記為A，變質(zhì)樣品記為B，培養(yǎng)條件見表1。每個樣品做3 個平行實驗。從不同選擇性培養(yǎng)基的平板上，挑取各種典型生長的菌落，隨后在其各自培養(yǎng)基上劃線分離2 ～3 次，得到純化的單個菌落。

表1 各種菌的培養(yǎng)條件及選擇性培養(yǎng)基

1.2.2 觀察菌落特征和菌體形態(tài)

菌落特征：觀察菌落表面呈現(xiàn)出的形狀（褶皺、崎嶇、平滑）、菌落表面形態(tài)（干燥、濕潤）、菌落大小、邊緣形狀（缺刻狀、光滑、波狀、樹枝狀）、菌落顏色。

菌體形態(tài)：觀察芽孢位置（中間、極端）、芽孢是否膨大、芽孢形狀（桿狀、橢圓、球狀）。

1.2.3 DNA 的提取與純化

挑取各純化單菌落于營養(yǎng)肉湯中搖床過夜培養(yǎng)，吸取細菌培養(yǎng)液2 mL，參照細菌基因組DNA 提取試劑盒要求操作。

1.2.4 16SrDNA 的PCR 擴增

選用細菌通用引物5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'；5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[1]。先用20 μL 體系進行PCR 預實驗，反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，設置52 ℃、53 ℃、54 ℃、 55 ℃、56 ℃、57 ℃[2]梯度變性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像檢測，觀察目標條帶大小，并確定合適PCR 反應條件，最后選取50 μL 體系，即Mix Ex Taq（25 μL）、上游引物（1.25 μL）、下游引物（1.25 μL）、模板 （1.25 μL）、重蒸水（21.25 μL）進行PCR 反應，割膠回收并純化，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。對照實驗，DNA 模版替換為重蒸水。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡椒鳳爪腐敗菌的菌落特征和菌體形態(tài)

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察各種菌體的形態(tài)結(jié)構，并結(jié)合各腐敗菌在瓊脂固體培養(yǎng)基上的菌落特征進行判斷，結(jié)果見表2。表2 中A 為合格樣品，B 為變質(zhì)樣品，A1～A4為合格樣品分離檢出的菌株；B1～B10為變質(zhì)樣品分離檢出的菌株。

表2 泡椒鳳爪中分離到的各菌株的形態(tài)特征

如表2 所示，有4 種微生物在兩種樣品中均有檢出，根據(jù)微生物形態(tài)分析可知，兩種樣品均有乳酸菌生長，因為泡椒鳳爪的pH 值偏酸性，pH 值為4.5 ～5.0，且泡椒鳳爪中的泡椒為乳酸菌發(fā)酵，乳酸菌是正常的有益菌，可抑制腐敗菌的生長[3]。B 組樣品為脹袋變質(zhì)泡椒鳳爪，初步判斷引起腐敗的為葡萄球菌、假單胞菌、芽孢桿菌，至于樣品在腐敗變質(zhì)的過程中微生物區(qū)系的變化和優(yōu)勢腐敗菌的腐敗機制還不清楚，有待進一步研究。

2.2 DNA 提取、PCR 擴增及測序

預實驗證實退火溫度設置為56 ℃較適宜，PCR擴增16S rDNA 基因片段的凝膠成像圖，測序結(jié)果也表明，PCR 實驗所獲得的擴增產(chǎn)物為實驗目的菌株16S rDNA 基因片段。測序結(jié)果見表3。

表3 分離細菌的16S rDNA 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果

PCR 測序結(jié)果與細菌形態(tài)學表現(xiàn)基本一致，其中A1、B1魏斯氏菌屬，是兼性厭氧菌或微需氧菌，常見于泡菜中，也是國外香腸制品的發(fā)酵菌之一[4-5]，在正常泡椒鳳爪和腐敗樣品中均存在，可能是泡椒的發(fā)酵菌。

Staphylococcus pasteuri和Staphylococcus cohnii、Staphylococcussp. 都 屬 于 葡 萄 球 菌 科，Staphylococcus pasteuri兼性厭氧，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無法引起泡椒鳳爪漲袋變質(zhì)；Staphylococcus cohnii被醫(yī)學研究中心證明抗藥性較高，在我國廣西及湖北部分鴨養(yǎng)殖場有發(fā)現(xiàn)，但其無毒力因子基因檢出，目前還未有雞養(yǎng)殖場報道，但雞鴨有一些相似的生活特性，因此推測其可能來源于雞養(yǎng)殖場；健康禽類的皮膚、羽毛、腸道等都有Staphylococcussp.存在，它是家禽孵化、飼養(yǎng)、加工環(huán)境中的常見微 生物。

Bacillus subillis常見于飼料中，可改善雞腸道菌群，促進吸收；Bacillus amyloliquefaciens在肉雞中可用來改善腸道免疫功能，具有抗氧化的作用；Bacillus licheniformis可降解重金屬，有效提高肉雞的生長性能、免疫力和抗氧化能力。Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis可能都是來源于雞飼料殘留。

Pseudomonassp.在自然界分布廣泛，主要分布在潮濕環(huán)境中。泡椒鳳爪產(chǎn)品有鳳爪、泡椒、泡椒液，適宜Pseudomonassp.生長。Pseudomonas aeruginosa是一種條件致病菌，在4℃不生長，可采用4 ℃冷藏泡椒鳳爪，來抑制其生長繁殖；Pseudomonas alcaliqenes，適宜溫度35 ℃，可能來源于水源污染。

變質(zhì)樣品比合格樣品多出的微生物可能是導致泡椒鳳爪變質(zhì)的腐敗菌，但由于未接種合格樣品且未進行腐敗機制研究，先不排除，結(jié)合上文及表3來看，引起泡椒鳳爪腐敗變質(zhì)可能是Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。建議加強雞爪采購源頭治理，加強加工過程管理，采用4 ℃冷鏈儲藏銷售，減少微生物污染。

3 結(jié)論

本實驗通過傳統(tǒng)細菌形態(tài)學和16SrDNA 檢測泡椒鳳爪中腐敗菌10 種，引起泡椒鳳爪變質(zhì)可能有Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。腐敗菌變變質(zhì)機制、變質(zhì)途徑等有待進一步研究分析。