西沙海綿共附生放線菌ITBB-ZK-a5的分離鑒定及抗菌活性研究

齊敏 郭志凱 熊子君 張世清 吳煒城 李吉濤

摘??要：海洋放線菌因其所處環(huán)境特殊，在生理性狀和遺傳背景方面均具有獨(dú)特的性質(zhì)，因此海洋放線菌具有產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物的巨大潛力。本研究以西沙海綿為研究對(duì)象，挖掘其具有抑菌活性的共附生放線菌資源。首先，利用平板分離法從海綿樣品中分離純化出一株活性放線菌菌株ITBB-ZK-a5，對(duì)其進(jìn)行16S?rRNA基因測(cè)序，結(jié)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和菌落形態(tài)特征，確定該菌株為鏈霉菌。其次，采用平板對(duì)峙法研究菌株ITBB-ZK-a5對(duì)植物病原真菌的抑菌廣譜性和持效性。結(jié)果表明：該菌株對(duì)供試的16株病原真菌均有較好的抑菌活性，抑菌譜較廣，且對(duì)峙14、30?d仍具有活性，抑菌持效性較好；為了進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株平板通過產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，對(duì)菌落邊緣的無菌瓊脂塊進(jìn)行抑菌活性研究，結(jié)果表明抑菌率與菌落距離呈負(fù)相關(guān)，說明放線菌可能通過向平板中分泌活性物質(zhì)以抑制病原菌的生長(zhǎng)。該菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接5代后，仍具有較好的世代穩(wěn)定性。再次，利用大米固體培養(yǎng)基對(duì)菌株ITBB-ZK-a5進(jìn)行發(fā)酵，乙酸乙酯萃取濃縮得到提取物，通過濾紙片法對(duì)發(fā)酵粗提物進(jìn)行光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，隨著水浴溫度升高和紫外照射時(shí)間的增加，菌株ITBB-ZK-a5對(duì)香蕉炭疽病病原菌的抑制效果呈下降趨勢(shì)，但仍具有較強(qiáng)的抑菌活性。最后，測(cè)定菌株ITBB-ZK-a5對(duì)香蕉炭疽病病原菌的半最大效應(yīng)濃度（EC50）為38.88?μg/mL，對(duì)木瓜炭疽病病原菌的EC50值為11.70?μg/mL。本研究對(duì)南海海綿共附生放線菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選出具有抑制多種熱帶作物病原真菌活性的生防菌株ITBB-ZK-a5，并對(duì)其進(jìn)行抑菌活性研究，為后續(xù)生防菌株的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海綿；海洋放線菌；抗植物病原真菌；抑菌活性；生防菌株中圖分類號(hào)：S476.1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Isolation，?Identification?and?Anti-phytopathogenic?Fungi?Activity?of?Symbiotic?Actinomycetes?from?Xisha?Sponge

QI?Min1，2，?GUO?Zhikai2，3，?XIONG?Zijun2，?ZHANG?Shiqing2，?WU?Weicheng1，2，?LI?Jitao1*

1.?Hubei?Key?Laboratory?of?Biological?Resources?Protection?and?Utilization?（Hubei?Minzu?University），?Enshi，?Hubei?445000，?China;?2.?Hainan?Key?Laboratory?of?Tropical?Microbe?Resources?/?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?3.?Hainan?Key?Laboratory?for?Protection?and?Utilization?of?Tropical?Bioresources?/?Hainan?Institute?for?Tropical?Agricultural?Resources，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China

Abstract：?Marine?actinomycetes?possess?great?capacity?in?producing?special?metabolites?due?to?their?special?environment?and?unique?properties?in?physiological?characters?and?genetic?background.?In?this?study，?sponge?was?used?as?isolation?material?to?explore?the?resources?of?symbiotic?actinomycetes?with?antibacterial?activity.?Firstly，?an?active?actinomycetes?strain，?ITBB-ZK-a5，?was?isolated?and?purified?from?the?sample?of?Xisha?sponge?by?plate?separation?method.?The?strain?was?identified?as?Streptomyces?by?analysis?of?the?phylogenetic?tree?based?on?16S?rRNA?gene?sequence?and?colony?morphological?characteristics.?Secondly，?the?inhibitory?spectrum?of?strain?ITBB-ZK-a5?against?plant?pathogenic?fungi?was?studied?by?plate?confrontation?method.?The?results?showed?that?ITBB-ZK-a5?had?a?broad?antibacterial?spectrum，?in?which?the?16?tested?pathogenic?fungi?were?inhibited?significantly.?ITBB-ZK-a5?also?showed?good?antibacterial?activity?in?14?days?and?30?days.?In?order?to?explore?the?reason?why?strain?ITBB-ZK-a5?can?inhibit?the?growth?of?pathogenic?bacteria，?the?antibacterial?activity?of?asepsis?agar?from?the?ITBB-ZK-a5?edge?were?determined，?and?the?results?showed?that?the?antibacterial?rate?were?negatively?correlated?with?colony?distance.?This?result?revealed?that?actinomycetes?maybe?can?secrete?active?substances?to?inhibit?the?growth?of?pathogenic?bacteria.?Thirdly，?the?strain?had?a?good?antibacterial?stability?by?detecting?the?antimicrobial?activity?of?five?continuously?dynasties.?Again，?light?stability?and?thermal?stability?of?the?ITBB-ZK-a5?crude?extracts?from?the?rice?solid?fermentation?were?tested?through?the?filter?method;?the?results?show?that?with?the?increase?of?bath?temperature?and?UV?duration，?the?antibacterial?activity?of?the?strain?ITBB-ZK-a5?crude?extracts?were?decreased.?Finally，?the?EC50?value?of?strain?ITBB-ZK-a5?against?anthrax?diseases?of?banana?and?papaya?were?determined.?Plant?diseases?infected?by?fungi?are?the?main?agricultural?diseases，?and?chemical?pesticides?are?the?most?commonly?used?method?in?diseases?control.?However，?the?widespread?use?of?chemical?pesticides?will?not?only?enhance?crop?resistance?to?drugs，?but?also?cause?pollution?to?the?ecological?environment.?More?importantly，?pesticide?residues?also?have?a?certain?influence?on?human?health.?Therefore，?the?common?goal?of?the?world?is?to?find?more?green，?efficient?and?safe?control?methods.?Actinomycetes?are?found?to?have?biological?control?effects.?The?symbiotic?actinomycetes?isolated?from?sponges?have?an?inhibitory?effect?on?pathogenic?fungi?of?tropical?crops，?which?can?be?applied?to?efficient?diseases?control，?conforming?to?the?concept?of?green?environmental?protection.?In?this?paper，?we?isolated?and?identified?the?strain?ITBB-ZK-a5，?symbiotic?actinomycetes?from?South?China?Sea?sponge，?which?has?the?activity?of?inhibiting?pathogenic?fungi?of?various?tropical?crops，?and?studied?its?antibacterial?activity，?providing?a?research?basis?for?the?development?and?utilization?of?biocontrol?strains?in?the?future.

Keywords：?sponge;?marine?actinomycetes;?anti-phytopathogenic?fungi;?antibacterial?activity;?bio-control?strain

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.023

放線菌是一種重要的藥用微生物資源，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物已被廣泛用于抗菌、抗病毒、殺蟲和抗腫瘤藥物研發(fā)[1]。因此，人們?cè)絹碓街匾晱牟煌h(huán)境條件中分離得到放線菌，并多層次研究發(fā)酵培養(yǎng)條件以獲取更多感興趣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]。放線菌（Actinomycetes）是一類單細(xì)胞革蘭氏陽性細(xì)菌，（G+C）%含量較高，因其菌落類似真菌的孢子絲而得名[3]。迄今已知的可利用的放線菌多數(shù)來自土壤，但經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的探索，從陸生放線菌中發(fā)現(xiàn)新抗生素的幾率已經(jīng)很低，于是人們將目光轉(zhuǎn)向占地球表面積70%以上的潛在資源庫——海洋[4-5]。

海洋特有的高鹽、低營(yíng)養(yǎng)、高壓和低溫等環(huán)境，使生活在其中的包括放線菌在內(nèi)的微生物具有區(qū)別于陸生種群的生理結(jié)構(gòu)和功能，并形成獨(dú)特的代謝途徑，因此造就了豐富的海洋微生物資源，成為巨大的生物資源庫和豐富的代謝產(chǎn)物庫，同時(shí)也是海洋微生物新天然產(chǎn)物挖掘的重要來源之一[6]。海綿（marine?sponge）是迄今為止海洋天然產(chǎn)物的最大來源[7]。海綿屬于動(dòng)物界多孔動(dòng)物門（Porifera），是一大類低等多細(xì)胞海洋動(dòng)物，主要生活于海洋中的巖石。海綿是底棲濾食性動(dòng)物[8-9]，其體內(nèi)和體表富集了大量的微生物，這些微生物與海綿形成了附生、共生或者內(nèi)生的相互關(guān)系[10]。海綿雖然是一類非常簡(jiǎn)單、原始的海洋生物，卻能產(chǎn)生比其他海洋生物物種更豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在海綿的化學(xué)防御中起到重要的作用[11]，同時(shí)還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧疾、抗污染、驅(qū)蟲和酶抑制劑等活性，具有潛在的藥用開發(fā)價(jià)值[12-14]。

真菌侵染引起的植物病害是農(nóng)業(yè)上最主要的病害，化學(xué)農(nóng)藥是最常用的防治方法，但不合理使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)增加有害生物的抗性風(fēng)險(xiǎn)，且易造成環(huán)境污染，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題[15]。因此，尋找更加綠色、高效、安全的防治方法是全世界的共同目標(biāo)[16]。放線菌是最早發(fā)現(xiàn)的具有生物防治作用的一類微生物[17]，從海綿中尋找對(duì)熱帶作物病原真菌具有抑制作用的共附生放線菌，具有用于高效防治病害的特色放線菌資源的潛力。海南省西沙群島地處熱帶，海綿種類繁多，為海綿共附生放線菌的研究提供了豐富的材料。本研究從西沙群島采集的莖狀管指海綿（Siphono c halina?truncata）樣品中分離得到具有抑菌活性的共附生放線菌，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，并分析其對(duì)農(nóng)業(yè)病原菌的抑菌譜、抑菌持效性、穩(wěn)定性以及EC50值，研究結(jié)果可為尋找特色、高效的生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??供試樣品??供試海綿采自海南省三沙市永興島海邊，裝入無菌自封袋，于?0?℃保存。

1.1.2??供試植物病原真菌??香蕉枯萎病病原菌（Fusarium?oxysporum?f.?sp.?cubense，?FOC?1和FOC?4）、香蕉炭疽病病原菌（Colletotrichum?musae）、木瓜和芒果炭疽病病原菌（C.?gloeosporioides）、木瓜褐色蒂腐病病原菌（Phomopsis?caricae-papayae?Fetrak?&?Cif.）、木瓜潰瘍病病原菌（Lasiodiplodia?theobromae）、辣椒炭疽病病原菌（C.?capsici）、辣椒葉斑病病原菌（Corynespora?sp.）、豇豆灰斑病病原菌（Corynespora?sp.）、豇豆莖基腐爛病病原菌[Pythium?aphanidermatum?（Eds.）?Fitzp.]、椰棗和龍船葉斑病病原菌（Pestalotiopsis?microspora）、椰子果腐病病原菌（Thielaviopsis?paradoxa）、水稻稻瘟病病原菌（Pyricularia?oryzae）、小麥赤霉病病原菌（Fusarium?graminearum?Schw.）、棉花黃萎病病原菌（Verticillium?dahliae）、橡膠炭疽病病原菌（C.?acutatum）、黃瓜根腐病病原菌（F.?solani）、火龍果果腐病病原菌（Gilbertella?persicaria）、荔枝霜疫霉病病原菌（Peronophythora?litchii）、龍船花炭疽病病原菌（C.?australianum）、水稻紋枯病病原菌[Thanatephorus?cucumeris?（Frank）?Donk]。以上病原真菌保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.2??方法

1.2.1??海綿共附生放線菌的分離與純化??用無菌半海水（含海鹽17.5?g/L）浸洗海綿3次，除去表面附著的雜質(zhì)，倒入無菌研缽中，剪碎，加入2～3?mL無菌半海水研磨成糊狀，無菌半海水稀釋至10?1、10?2，取100?μL研磨液和各稀釋梯度溶液分別涂布于高氏合成1號(hào)固體培養(yǎng)基[可溶性淀粉20.0?g/L，氯化鈉6.5?g/L，硫酸亞鐵0.01?g/L，硫酸鉀1.0?g/L，硫酸氫二鉀0.5?g/L，硫酸鎂0.5?g/L，瓊脂20.0?g/L，海鹽17.5?g/L，重鉻酸鉀50?μg/mL，pH為（7.3±0.2）]平板[18]，于28?℃倒置培養(yǎng)30?d。從培養(yǎng)基中挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的放線菌ITBB-ZK-a5菌落轉(zhuǎn)接至ISP?2固體培養(yǎng)基[酵母提取物4.0?g/L，麥芽提取物10.0?g/L，葡萄糖4.0?g/L，瓊脂20.0?g/L，海鹽17.5?g/L，pH為（7.2±0.2）]中進(jìn)行純化和培養(yǎng)[19]。

1.2.2??16S?rRNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建??純化菌株ITBB-ZK-a5由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)定16S?rRNA基因序列，將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，在MEGA軟件中進(jìn)行多序列分析，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.2.3??菌株ITBB-ZK-a5對(duì)病原真菌的抑菌持效性研究??用劃線法研究菌株ITBB-ZK-a5的抑菌持效性，選擇放線菌-病原真菌共培養(yǎng)：將放線菌劃線接種（約45?mm?10?mm的條帶）至馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）的兩端（距邊緣約20?mm），于28?℃培養(yǎng)4?d后，將供試病原真菌菌塊（直徑7?mm）分別接種在PDA平板中央（距離兩端的放線菌帯約20?mm），只接病原真菌的為對(duì)照，于28?℃培養(yǎng)7、14、30?d，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率[21-22]。抑菌率=[（對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)直徑-病原菌塊直徑）-（處理組病原菌生長(zhǎng)直徑-病原菌塊直徑）]/（對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)直徑-病原菌塊直徑）?100%。

1.2.4??菌株ITBB-ZK-a5平板活性物質(zhì)擴(kuò)散研究??為了進(jìn)一步驗(yàn)證菌株ITBB-ZK-a5平板通過產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制病原真菌的生長(zhǎng)，在ISP?2平板上1/2區(qū)域進(jìn)行劃線，于28?℃培養(yǎng)至放線菌產(chǎn)孢，繼續(xù)培養(yǎng)7?d后，分別在距離產(chǎn)孢區(qū)域5、10、15?mm位置處取直徑為7?mm的瓊脂塊，5?mm位置為1號(hào)位，10?mm位置為2號(hào)位，15?mm位置為3號(hào)位[23]。采用平板對(duì)峙法：PDA平板中間接種供試植物病原真菌，左右兩側(cè)距離邊緣20?mm處分別接1、2、3號(hào)位瓊脂塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，只接病原真菌的為對(duì)照，于28?℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿平板，觀察并記錄，計(jì)算抑菌率。

1.2.5??菌株ITBB-ZK-a5的抑菌穩(wěn)定性研究??（1）世代穩(wěn)定性研究。對(duì)菌株ITBB-ZK-a5連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，采用平板對(duì)峙法研究不同代ITBB-ZK-a5的抗菌穩(wěn)定性，選擇豇豆灰斑病病原菌為指示菌，PDA平板中心接指示菌，距菌塊左右20?mm處接放線菌，重復(fù)3次，只接病原真菌的為對(duì)照，于28?℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿平板，觀察并記錄[20]。

（2）菌株發(fā)酵提取物的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性研究。將菌株ITBB-ZK-a5用大米固體培養(yǎng)基（每瓶200?mL組培瓶中含大米30?g，半海水45?mL，121?℃高壓滅菌30?min），發(fā)酵30?d，乙酸乙酯萃取過濾，合并濃縮得到發(fā)酵提取物，將發(fā)酵提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解成濃度為10?mg/mL的樣品液，分別置于40、50、60?℃下水浴1?h和紫外燈下照射1、2、4、6、8、10?h。以香蕉炭疽病病原菌為指示菌，利用平板濾紙片法測(cè)定抑菌活性：將直徑為7?mm的香蕉炭疽病病原菌菌塊接種至PDA平板中央，在距離中央20?mm處左右各放置1張直徑為7?mm的濾紙片，以多菌靈（有效含量98%）、百菌清（有效含量75%）、腈菌唑（有效含量40%）作陽性對(duì)照，以只接種病原真菌的平板為陰性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28?℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿平板，觀察并記錄，計(jì)算抑菌率[20]。

1.2.6??測(cè)定菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物對(duì)病原真菌的EC50值??將上述80?mg/mL發(fā)酵提取物樣品液，以DMSO依次2倍稀釋，再將各個(gè)梯度按1/1000的比例加到PDA培養(yǎng)基中混勻，制成含發(fā)酵提取物濃度為80、40、20、10、5、2.5?μg/mL的固體平板，分別接種香蕉炭疽病和木瓜炭疽病病原菌菌塊（直徑7?mm）至平板中央，以含等濃度腈菌唑的平板為陽性對(duì)照，含等體積DMSO的PDA平板為陰性對(duì)照，每組重復(fù)3次，置于28?℃培養(yǎng)8～10?d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。將抑菌率轉(zhuǎn)化為幾率值，濃度取對(duì)數(shù)；采用Excel?2013軟件求出對(duì)應(yīng)的回歸方程（y=a+bx）和相關(guān)系數(shù)（R2），以抑菌率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的幾率值求出半最大效應(yīng)濃度（EC50）[24]。

2??結(jié)果與分析

2.1??菌株的分離與純化

分離、純化得到的活性放線菌菌株ITBB-ZK-?a5在ISP?2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，于28?℃培養(yǎng)2～4?d后開始產(chǎn)生孢子，培養(yǎng)5?d后孢子堆顏色接近白色，呈粉狀或絨毛狀，后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加孢子堆顏色逐漸變成淺灰色、灰色，最后變成黑色。其菌落形態(tài)圖（培養(yǎng)7?d）如圖1。

2.2??菌株ITBB-ZK-a5的16S?rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

對(duì)菌株ITBB-ZK-a5進(jìn)行16S?rRNA基因序列分析，將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST相似性對(duì)比，選擇相似度大于98%的菌株的16S?rRNA基因序列作為參比對(duì)象，在MEGA軟件中進(jìn)行多序列比對(duì)。通過構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株ITBB-ZK-a5的16S?rRNA基因（GenBank登錄號(hào)OP132967）與Streptomyces?malaysiens（AB249918.1）的同源性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步判斷菌株ITBB-ZK-a5可能為Streptomyces?malaysiens（圖2）。

2.3??菌株ITBB-ZK-a5對(duì)病原真菌的抑菌作用及持效性

通過放線菌-真菌共培養(yǎng)研究菌株ITBB-ZK-?a5對(duì)16株病原真菌的抑菌活性，結(jié)果表明，菌株ITBB-ZK-a5對(duì)供試的16株病原真菌均具有一定程度的抑菌活性，說明該菌株抑菌譜較廣，其中對(duì)香蕉炭疽病和木瓜炭疽病病原菌的抑制效果最好，抑制率分別為98.71%和98.29%；其次是對(duì)龍船葉斑病、荔枝霜疫霉病、辣椒炭疽病等病原真菌的抑制效果也較好，抑菌率均在94%以上，而對(duì)火龍果果腐病病原菌的抑制效果相對(duì)較低，抑制率為75.64%，對(duì)其他病原真菌的抑制率均在80%～90%之間。菌株ITBB-ZK-a5對(duì)炭疽類植物病原真菌具有一定的專一性，且抑菌活性強(qiáng)，對(duì)香蕉炭疽病、木瓜炭疽病、辣椒炭疽病病原菌的抑菌率均達(dá)90%以上（表1）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在對(duì)峙培養(yǎng)14、30?d后仍具有抑菌活性，由于培養(yǎng)基直徑的局限性以及隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分逐漸減少，抑菌率有一定的下降，但最終趨于穩(wěn)定，表明菌株ITBB-ZK-a5具有較好的抑菌持效性。

2.4??菌株ITBB-ZK-a5的平板活性物質(zhì)擴(kuò)散研究

利用平板對(duì)峙法對(duì)菌株ITBB-ZK-a5活性物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)行了初步研究，1號(hào)位、2號(hào)位和3號(hào)位瓊脂塊的抑制效果呈較為明顯的遞減趨勢(shì)，距離括號(hào)內(nèi)為序列GenBank登錄號(hào)；分支處的數(shù)字表示bootstrap支持率；標(biāo)尺為5%的序列進(jìn)化差異。

菌落越近的瓊脂塊，抑制效果越明顯（圖3），其中對(duì)水稻稻瘟病病原菌的抑菌性最好，1、2、3號(hào)位瓊脂塊的抑菌率分別為75.86%、62.64%、59.77%，且1號(hào)位與2號(hào)位、3號(hào)位的抑菌率之間具有顯著性差異；對(duì)椰子果腐病和荔枝霜疫霉病病原菌的抑制效果較低；對(duì)其他病原真菌的抑菌率也隨著菌落距離變遠(yuǎn)而減弱，抑菌率在30%～60%之間。1、2、3號(hào)位瓊脂塊對(duì)病原真菌均有抑制活性，1號(hào)位的抑菌性最強(qiáng)，隨著菌落距離的變遠(yuǎn)，其抑菌率下降，其原因可能是菌株ITBB-ZK-a5菌落產(chǎn)生的活性物質(zhì)向平板擴(kuò)散，距離越遠(yuǎn)活性物質(zhì)越少，所以抑菌率呈下降趨勢(shì)，但仍具有抑菌活性，除了黃瓜根腐病病原菌以外，其余病原真菌的1、2、3號(hào)位之間均存在顯著性差異（表2）。

2.5??菌株ITBB-ZK-a5的世代穩(wěn)定性

以豇豆灰斑病病原菌為供試菌，通過平板對(duì)峙法研究了不同世代ITBB-ZK-a5菌株的抑菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株所有世代均對(duì)豇豆灰斑病病原菌有較好的抑菌活性，抑菌率均在60%以上，其中第四世代的抑菌活性最高（75.21%），并與其他世代的抑菌率之間均呈顯著性差異。

2.6??菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物抗植物病原菌的熱穩(wěn)定性

以香蕉炭疽病病原菌為供試菌，通過平板濾紙片法研究了菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，3種藥劑和發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香蕉炭疽病病原菌的抑菌效果均呈下降趨勢(shì)，抑菌活性最強(qiáng)的多菌靈（94.86%～?96.15%）和最弱的百菌清（44.86%～46.15%）在不同溫度處理后，其抑菌活性無顯著差異（P>?0.05），穩(wěn)定性好；抑菌活性居中的腈菌唑（73.07%～88.03%）在40、50、60?℃處理與室溫處理間具有顯著性差異，但是40、50、60?℃處理間無顯著差異，抑菌活性較穩(wěn)定；菌株ITBB-ZK-?a5發(fā)酵提取物的抑菌率（72.21%～79.05%）與腈菌唑的相當(dāng)，均保持在70%以上，其穩(wěn)定性也與腈菌唑類似，40、50、60?℃處理的抑菌活性顯著低于室溫處理，在40～60?℃具有較好的穩(wěn)定性（表3）。

2.7??菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物抗植物病原菌的光穩(wěn)定性

以香蕉炭疽病病原菌為供試菌，通過平板對(duì)峙法測(cè)定了菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵產(chǎn)物的光穩(wěn)定性。結(jié)果表明，隨著紫外光照時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌率呈下降趨勢(shì)，在0～8?h光照范圍內(nèi)，抑菌率逐漸下降，1、2?h處理的抑菌率與CK間無顯著性差異，4～8?h處理的抑菌率與CK間呈顯著性差異；10?h處理的抑菌率最低，并且與其他處理的抑菌率均呈顯著差異，與CK相比下降18.07%。菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物的抑菌活性在0～2?h紫外光照下具有很好的穩(wěn)定性，然后隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌活性顯著降低（表4）。

2.8??菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物對(duì)病原真菌的EC50值

以香蕉炭疽病和木瓜炭疽病病原菌為供試菌，通過平板稀釋法測(cè)定了菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物的EC50值，結(jié)果表明，菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物對(duì)香蕉炭疽病和木瓜炭疽病病原菌均有較好的抑制效果，EC50值分別為38.88、11.70?μg/mL，其中對(duì)木瓜炭疽病病原菌的抑制效果優(yōu)于香蕉炭疽病病原菌。但與化學(xué)藥劑腈菌唑相比，抑制效果稍弱（表5）。

3??討論

本研究從西沙群島采集的海綿中分離得到1株活性放線菌菌株ITBB-ZK-a5，通過16S?rRNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，將其鑒定為Streptomyces?malaysiens。進(jìn)一步的抑菌持效性和廣譜性研究結(jié)果表明，菌株ITBB-ZK-a5對(duì)供試的16株植物病原真菌均具有抑制活性，抑菌譜廣，且對(duì)峙培養(yǎng)14、30?d后仍有較好的抑菌活性，其中對(duì)炭疽類病原菌的抑制效果尤為顯著；對(duì)固體平板中代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究結(jié)果表明，抑菌率可能與代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散距離有關(guān)，距離越遠(yuǎn)，其抑制率越低；無論是世代穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性還是熱穩(wěn)定性研究，菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物的抑菌率均有小范圍波動(dòng)，且穩(wěn)定性較好；菌株ITBB-ZK-a5發(fā)酵提取物對(duì)香蕉炭疽病病原菌的EC50值為38.88?μg/mL，對(duì)木瓜炭疽病病原菌的EC50值為11.70?μg/mL，均具有較好的抑菌活性，表明海綿共附生放線菌在開發(fā)抑菌活性物質(zhì)和生防菌劑方面具有較大潛力。

海綿是世界上存在的最早的生命形式之一，其在海洋中的生物量?jī)H次于珊瑚，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，放線菌在海綿中的數(shù)量和種類均十分豐富，1993年IMAMURA等[25]從1種未知海綿中分離得到了單一鏈霉菌菌株，并分離出新的抗生素。2006年ZHANG等[26]利用8種不同的培養(yǎng)基，從海綿Hymeniacidon?perleve中分離得到可培養(yǎng)的放線菌屬、鏈霉菌屬、小單孢菌屬、紅球菌屬、諾卡氏菌屬等7個(gè)屬的106株放線菌，優(yōu)勢(shì)屬為鏈霉菌屬。隨后的許多研究均表明，海綿作為代表性的放線菌共附生海洋生物，其次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富，一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。近年來，對(duì)海綿共附生放線菌的研究發(fā)現(xiàn)，來源于鏈霉菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如雜環(huán)類、多肽類等，均表現(xiàn)出良好的抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲等活性，而抗菌活性尤為突出。EI-GENDY等[27]從海綿中分離出50株放線菌，其中10株均具有抗真菌活性，并首次從海綿鏈霉菌中分離到5，7-二甲氧基-4-對(duì)甲氧基苯香豆素和新的抗生素saadamycin。據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，547個(gè)海洋鏈霉菌新天然產(chǎn)物中，來源于海綿共附生鏈霉菌的新天然產(chǎn)物占64個(gè)，其中1/5的化合物表現(xiàn)出抗菌活性，目前已挖掘的藥用放線菌大多屬于鏈霉菌屬[28-30]。

本研究中的放線菌Streptomyces?malaysiens?ITBB-ZK-a5的形態(tài)特征與AL-TAI等[31]報(bào)道的S.?malaysiensis?ATB-llT，劉為營(yíng)等[32]報(bào)道的S.?malaysiens?1161形態(tài)特征一致，16S?rRNA基因序列同源性高，并且這類菌均表現(xiàn)出較好的抑菌活性，且均是從非海洋環(huán)境中分離得到；本研究發(fā)現(xiàn)的活性放線菌S.?malaysiens是從西沙群島采集的海綿樣品中分離得到，尚無該種放線菌從海綿中分離發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，從?20?℃保存的海綿樣品中分離獲得的放線菌數(shù)量少于前人[18]從新鮮樣品中分離獲得的菌種數(shù)量，因此，分離海洋生物樣品中的放線菌時(shí)應(yīng)在采集新鮮生物樣品后及時(shí)進(jìn)行菌株分離，以得到多樣性的菌株。

在熱帶作物病害中，有些病害蔓延迅速、危害范圍廣、防治困難，極易造成作物產(chǎn)量下降，損失嚴(yán)重。放線菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有高效性、低毒性、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在熱帶農(nóng)業(yè)病害防治中起到至關(guān)重要的作用。吉才娟等[33]在?？跒澈Ｄ嘀蟹蛛x出對(duì)芒果炭疽病菌具有較高抑菌活性的放線菌。郭志凱等[34]從海南西沙群島海綿中分離得到對(duì)香蕉枯萎病菌FOC?4等多種病原真菌均具有抑菌活性的2株鏈霉菌菌株，并從1株鏈霉菌菌株HMH1的大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到放線菌素D，研究發(fā)現(xiàn)放線菌素D對(duì)供試的香蕉枯萎病菌和木瓜潰瘍病菌等10種病原真菌及2種病原細(xì)菌（水稻白葉枯病菌和茄青枯勞爾氏菌）均具有抑菌活性。本研究以多種熱帶作物病原真菌作為指示菌，對(duì)菌株ITBB-ZK-a5進(jìn)行了抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)該菌不僅具有廣譜性，而且對(duì)部分同屬病原真菌具有普遍的抑菌性。本研究結(jié)果將為后續(xù)活性物質(zhì)的分離、鑒定以及大田活性評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)，為從海洋放線菌中篩選出對(duì)熱帶農(nóng)業(yè)病害具有抑制效果的生防菌株和活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)菌種資源和理論支撐。

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