木薯MePP2CAb基因克隆及表達分析

王舒婷 楊靜琳 林墁 李麗珍 劉博婷 吳春來 曾堅 胡偉

摘??要：2C型蛋白磷酸酶（protein?phosphatase?2C，?PP2C）在ABA核心信號途徑中發(fā)揮著重要作用。為了研究PP2C基因在木薯響應(yīng)非生物脅迫過程中的功能，本研究通過RT-PCR技術(shù)，從木薯Arg7中克隆得到MePP2CAb基因，并對其進行生物信息學(xué)分析、自激活活性分析、啟動子活性分析及不同逆境和激素處理下的表達模式分析。結(jié)果表明：（1）MePP2CAb基因的長度為1296?bp，包含431個氨基酸殘基，蛋白相對分子量和理論等電點分別為47.08?kDa和5.5，具有PP2C家族的結(jié)構(gòu)域特征。蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果顯示，MePP2CAb與橡膠樹和麻風(fēng)樹的PP2C序列最為相似，一致性分別為82.75%和74.01%，在C-端保守。上述結(jié)果證明MePP2CAb基因?qū)儆赑P2C家族。（2）MePP2CAb基因在木薯塊根中的表達最高。（3）MePP2CAb具有一定的自激活活性，MePP2CAb基因的全長啟動子的活性也較高。（4）MePP2CAb基因?qū)儆贏BA核心通路，啟動子序列分析顯示，它包含ABRE（abscisic?acid?responsiveness）元件、MeJA響應(yīng)原件、干旱誘導(dǎo)元件（drought-induced?motif）等元件。不同逆境和激素處理的結(jié)果也表明，MePP2CAb基因在冷處理和SA處理下受到抑制，在NaCl、mannitiol、ABA和MeJA處理的過程中受到誘導(dǎo)。另外酵母雙雜交結(jié)果顯示MePP2CAb能夠與MePYL1產(chǎn)生互作。根據(jù)上述結(jié)果推測，MePP2CAb基因可能對木薯的非生物脅迫有響應(yīng)，但其到底是正調(diào)控因子還是負調(diào)控因子尚不清楚。該結(jié)果為進一步研究解析MePP2CAb基因在ABA信號通路中的作用及提高木薯在非生物脅迫中的適應(yīng)能力提供參考。

關(guān)鍵詞：木薯；ABA；PP2C；非生物脅迫中圖分類號：S533??????文獻標(biāo)識碼：A

Cloning?and?Expression?Analysis?of?MePP2CAb?Gene?in?Cassava

WANG?Shuting1，?YANG?Jinglin1，?LIN?Man1，?LI?Lizhen1，?LIU?Boting1，?WU?Chunlai2，?ZENG?Jian1*，?HU?Wei2

1.?Guangdong?Provincial?Key?Laboratory?of?Utilization?and?Conservation?of?Food?and?Medicinal?Resources?in?Northern?Region?/?Henry?Fok?School?of?Biology?and?Agriculture，?Shaoguan?University，?Shaoguan，?Guangdong?512005，?China;?2.?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Science，?Haikou，?Hainan?571101，?China

Abstract：?Protein?phosphatase?2C?（PP2C）?plays?a?key?role?in?the?ABA?signaling?pathway.?In?order?to?investigate?the?response?process?of?the?PP2C?gene?to?abiotic?stress?in?cassava，?MePP2CAb?gene?was?cloned?from?Arg7?in?cassava?using?the?RT-PCR?technique.?Bioinformatic?analysis，?autoactivation?activity?analysis，?promoter?activity?analysis，?and?expression?pattern?analysis?of?the?MePP2CAb?gene?under?different?stress?and?hormone?treatments?were?conducted.?The?results?showed?that?（1）?the?total?length?of?the?MePP2CAb?gene?was?1296?bp，?encoding?431?amino?acid?residues.?The?MePP2CAb?protein?had?a?relative?molecular?weight?of?47.08?kDa?and?a?theoretical?isoelectric?point?of?5.5.?It?exhibited?structural?domain?characteristics?of?the?PP2C?family.?Protein?sequence?analysis?showed?that?MePP2CAb?was?most?similar?to?PP2C?sequences?of?Hevea?rubber?and?Jatropha?jatropha，?with?consistencies?of?82.75%?and?74.01%，?respectively，?and?a?conserved?C-terminal.?These?results?indicated?that?MePP2CAb?belongs?to?the?PP2C?family.?（2）?The?expression?of?the?MePP2CAb?gene?was?found?to?be?higher?in?cassava?storage?roots，?stems，?and?leaves，?with?the?highest?expression?observed?in?storage?roots.?（3）?MePP2CAb?demonstrated?self-activation?activity，?and?its?full-length?promoter?exhibited?high?activity.?（4）?The?MePP2CAb?gene?belongs?to?the?core?ABA?pathway，?and?promoter?sequence?analysis?showed?that?it?contained?ABRE?（abscisic?acid?responsiveness）?elements，?MeJA?response?elements，?and?a?drought-induced?motif.?Under?different?stress?and?hormone?treatments，?low?temperature?and?SA?treatment?significantly?repressed?the?MePP2CAb?gene，?while?mannitol，?NaCl，?ABA，?and?MeJA?significantly?induced?its?expression.?In?addition，?the?interaction?between?MePP2CAb?and?MePYL1?was?also?observed.?These?results?suggest?that?MePP2CAb?may?be?responsive?to?abiotic?stress?in?cassava，?although?its?role?as?a?positive?or?negative?regulatory?factor?remains?unclear.?These?results?provide?a?clue?for?further?investigation?into?the?role?of?the?MePP2CAb?gene?in?the?ABA?signaling?pathway?and?the?improvement?of?cassava's?adaptation?to?abiotic?stress.

Keywords：?cassava;?ABA;?PP2C;?abiotic?stress

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.004

脫落酸（abscisic?acid，?ABA）在植物的種子萌發(fā)、生長、開花和果實成熟等過程中發(fā)揮重要作用，并且也參與植物對非生物和生物脅迫等逆境響應(yīng)[1-5]。2009年，科學(xué)家們在擬南芥中闡明了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心通路，包括ABA受體PYR/PYL/RCARs、A類蛋白磷酸酶2Cs以及蛋白激酶SnRK2s[6]。

干旱是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生重要影響的因素之一，它會對作物的生長產(chǎn)生影響，從輕微的產(chǎn)量下降到嚴(yán)重的作物絕收[7-8]。植物對非生物脅迫的響應(yīng)主要通過激素實現(xiàn)，其中ABA是應(yīng)對干旱脅迫的重要激素[9]。當(dāng)遭受干旱脅迫時，植物體內(nèi)的ABA含量增加，而ABA的增加會影響許多基因的表達，包括ABA依賴途徑和非依賴途徑，其中ABREs是ABA依賴途徑中的關(guān)鍵反應(yīng)元件[10-12]。研究表明，ABA信號傳導(dǎo)途徑中的PP2C?A亞家族成員通常作為負調(diào)節(jié)因子[6，?13]，該基因家族已在水稻、擬南芥、玉米、油菜和棉花等物種中被鑒定出來[14-18]。擬南芥的PP2C?A亞家族基因突變體abi1/abi2/hab1/pp2ca會負調(diào)控ABA信號[19-22]。此外，在擬南芥中過表達玉米ZmPP2C、ZmPP2c-A10基因和楊樹PP2C基因也可負調(diào)控ABA信號，從而降低轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽和干旱脅迫的耐受性[23-25]。

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）是一種重要的糧食作物，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植，被全球公認為第六大糧食作物，為近10億人提供碳水化合物[26-27]。木薯具備抗旱特性，因此可作為研究抗旱機制的典型材料[28]。目前，關(guān)于木薯中PP2C基因家族的研究還非常有限[29]。因此，為了深入研究PP2C基因在木薯抗逆過程中的功能，本研究克隆了MePP2CAb基因，對其編碼蛋白序列進行生物信息學(xué)分析。同時研究MePP2CAb基因的啟動子活性以及與ABA信號通路的上游成員MePYLs之間的相互作用。并分析MePP2CAb基因在不同逆境脅迫和激素處理下的表達模式，為深入研究MePP2CAb基因的功能提供參考依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

木薯品種Arg7由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。木薯Arg7通過莖稈插條進行繁殖，取生長期為60?d且長勢一致的Arg7幼苗，分別進行不同處理。激素處理：分別使用100?μmol/L?ABA、100?μmol/L?SA、100?μmol/L?MeJA進行噴施處理，并在處理后的0、2、6、12、24?h時間點采集葉片樣品；逆境處理：分別使用300?mmol/L?NaCl和200?mmol/L?mannitol進行澆灌處理，并在處理后的0、2、6?h和3、14?d時間點采集葉片樣品。4?℃處理后分別在0、2、6、12、48?h時間點取葉片樣品。將取得的葉片樣品迅速置入液氮中冷卻，并保存在?80?℃的冰箱中備用。

主要試劑：DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體、熒光定量PCR反應(yīng)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，感受態(tài)細胞（農(nóng)桿菌GV3101和大腸桿菌DH5α）購自諾唯贊生物科技有限公司，2?Taq?Master?Mix酶、Nimble?Clonig克隆試劑盒和T4連接酶購買自海南壹田生物科技有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶購買自Thermo?Fisher?Scientific。pGBKT7和pGreenII?0800-LUC表達載體保存在本課題組實驗室。儀器設(shè)備：PCR儀（耶拿，德國），EPS300電泳儀（Tanon，上海），4100凝膠成像儀（Tanon，上海），MX3000熒光定量PCR儀（安捷倫，美國），超微量紫外分光光度計（Thermo，美國），CT15RT高速冷凍離心機（TECHCOMP，中國）。

1.2??方法

1.2.1??啟動子的活性分析??采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將載體pGreen1I?0800-LUC-MePP2CAb轉(zhuǎn)化至GV3101感受態(tài)細胞，獲得陽性轉(zhuǎn)化子后，調(diào)整菌體的OD600至1.0，使用1?mL注射器，將其注射至生長2個月左右的煙草嫩葉葉片下表皮，注射后培養(yǎng)3?d，隨后測定雙熒光素酶含量，進行LUC/REN計算（6個重復(fù)）。

1.2.2??生物信息學(xué)分析??通過ExPASy?ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SOPMA軟件和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.?expasy.?org/）在線軟件，使用BLASTP（https：//blast.?ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和MEGA-5軟件進行搜索和同源序列比對，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap值設(shè)定為1000）。

1.2.3??基因表達分析??根據(jù)MePP2CAb序列設(shè)計熒光定量引物（表1），并選擇木薯MeTUB基因作為內(nèi)參基因，使用qRT-PCR技術(shù)對不同處理下的MePP2CAb基因表達模式進行分析（3次生物學(xué)重復(fù)）。相對表達量的計算采用2?ΔΔCT法[26]。

1.2.4??酵母雙雜交??首先進行自激活分析，使用PEG誘導(dǎo)方法，將載體pGBKT7-MePP2CAb轉(zhuǎn)化到酵母中，取200?μL涂板至一缺培養(yǎng)基（SD/-?Trp），在29?℃培養(yǎng)48～96?h，從SD/-Trp培養(yǎng)基上挑取長勢較好的單菌落，使用PCR法驗證陽性轉(zhuǎn)化子，用液體SD/-Trp培養(yǎng)基活化陽性轉(zhuǎn)化子菌落，用ddH2O稀釋至合適濃度，取2?μL菌落水溶液分別點到SD/-Trp、SD/-His和SD/-His/?+x-a-gal培養(yǎng)基上，于29?℃培養(yǎng)，觀察生長狀況。根據(jù)相關(guān)基因的上下游互作關(guān)系，它們被分別構(gòu)建到pGADT7和pGBKT7載體中，并提取陽性重組克隆菌液的質(zhì)粒。以pGADT7-T和pGBKT7-53作為陽性對照，pGADT7-T和pGBKT7-Lam作為陰性對照，將陽性對照質(zhì)粒組合、陰性對照質(zhì)粒組合以及構(gòu)建的重組質(zhì)粒組合兩兩轉(zhuǎn)化到AH109酵母感受態(tài)中培養(yǎng)觀察基因編碼蛋白的互作情況。挑取二缺培養(yǎng)基（LT/-Trp/-Leu）上的長勢較好的單菌落，使用PCR法驗證陽性轉(zhuǎn)化子；用液體（LT/-Trp/-Leu）培養(yǎng)基活化陽性轉(zhuǎn)化子菌落，挑取原始菌落，然后按梯度稀釋，即1和10?1；吸取菌落水溶液2??L，分別點到二缺和四缺培養(yǎng)基（LTAH/-Trp/-Leu/-Ade/-His）上，于29?℃培養(yǎng)，觀察生長狀況。

2??結(jié)果與分析

2.1??MePP2CAb基因克隆

在鑒定木薯的PP2C?A亞基因家族時，課題組發(fā)現(xiàn)其中1個基因序列Manes.07G119400顯著受到ABA和PEG處理的誘導(dǎo)（圖1）。基于該序列，

設(shè)計引物并成功擴增出1個1296?bp的片段（圖2）。測序結(jié)果顯示，該序列編碼的氨基酸殘基數(shù)量為431，命名為MePP2CAb基因。MePP2CAb蛋白的分子式為C2004H3254N596O657S27，相對分子量為47.08?kDa，理論等電點為5.5，不穩(wěn)定系數(shù)（46.66）顯示它為不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)木薯基因組序列，MePP2CAb基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，MePP2CAb蛋白的無規(guī)則卷曲占比42.92%，α-螺旋占比37.12%，延伸鏈占比13.23%，β-轉(zhuǎn)角占比6.73%。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，MePP2CAb蛋白含有PP2C家族結(jié)構(gòu)域（圖3）。以上預(yù)測結(jié)果表明MePP2CAb基因?qū)儆赑P2C基因家族的成員。

2.2??MePP2CAb蛋白的序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用blastp方法，本研究獲得了與MePP2CAb蛋白序列相似性較高（>65%）的其他PP2C基因的蛋白序列。蛋白序列比對結(jié)果顯示，與MePP2CAb的一致性最高的是橡膠樹中的PP2C基因（XP_021656015.1），達到82.75%，其次是麻瘋樹（XP_012088646.1），一致性為74.01%。MePP2CAb蛋白序列與其他PP2C基因蛋白序列具有較高的保守性，尤其是在C端（圖4）。進化分析結(jié)果進一步證實，MePP2CAb與HbPP2C24處于同一分支（圖5），木薯和橡膠樹均屬于大戟科植物，進一步證明PP2C蛋白氨基酸序列具有高度保守性。

2.3??MePP2CAb基因的表達分析

為了分析MePP2CAb基因在木薯不同組織中的表達水平，本研究對木薯的根、莖、葉等3種組織中MePP2CAb基因的表達模式進行分析。如圖6所示，MePP2CAb基因在葉和莖中的表達量相似，而在根中的表達量最高。

其次，對MePP2CAb基因在不同脅迫和激素處理下的表達情況進行分析。在NaCl處理下，MePP2CAb基因的表達量先增加，在6?h達到最高水平后逐漸降低（圖7A）；在mannitiol處理下，MePP2CAb基因的表達量在2?h時達到最高水平（圖7B）；而在冷處理下，MePP2CAb基因的表達量受到抑制（圖7C）。在MeJA處理下，MePP2CAb基因的表達量隨著處理時間的增加先增加，在6?h達到最高水平后逐漸降低（圖7D）；在ABA處理下，MePP2CAb基因的表達量在24?h達到最高水平（圖7E）；然而，在SA處理下，MePP2CAb基因的表達量在所有處理時間點均被抑制（圖7F）。以上結(jié)果表明，MePP2CAb基因在冷處理和SA處理下受到抑制，在NaCl、

2.4??MePP2CAb基因啟動子的活性分析

MePP2CAb基因的啟動子序列分析結(jié)果顯示（PlantCARE數(shù)據(jù)庫），該啟動子包含5個ABRE順式調(diào)控元件、3個MeJA響應(yīng)元件和1個干旱誘導(dǎo)元件（圖8A）。為了評估MePP2CAb基因啟動子的活性，本研究將MePP2CAb基因的啟動子構(gòu)建到pGreenII?0800-LUC載體上，即pGreenII?0800-LUC-?MePP2CAb（?1500～0）。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將該載體瞬時轉(zhuǎn)化到煙草葉片中，并使用雙熒光素酶測定試劑盒測定MePP2CAb?基因啟動子活性。結(jié)果顯示，MePP2CAb基因的全長啟動子具有較高的活性（圖8B）。

2.5??酵母雙雜交互作初步驗證MePP2CAb基因參與ABA信號通路

為了驗證MePP2CAb是否具有自激活能力，本研究將其構(gòu)建到pGBKT7載體上，并進行驗證。結(jié)果如圖8C所示，pGBKT7-MePP2CAb在一缺培養(yǎng)基（SD/-Trp和SD/-His）上正常生長，并在SD/-His/x-a-gal培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出藍色。結(jié)果表明，MePP2CAb具有一定的自激活活性。因此，后續(xù)的酵母雙雜實驗需將其構(gòu)建至pGADT7載體。

在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，PYLs位于PP2C?A亞家族的上游，為了證明MePP2CAb參與ABA信號通路，本研究克隆了MePYL1～MePYL4基因，并將其連接至pGBKT7載體上。通過驗證PYLs與PP2C?A之間的相互作用關(guān)系，結(jié)果如圖8D所示，所有組合在二缺培養(yǎng)基上都能正常生長；在四缺培養(yǎng)基上，MePP2CAb+MePYL1和pGADT7-T+pGBKT7-53陽性對照有菌落形成；而MePP2CAb+MePYL2?/?MePYL3?/?MePYL4組合及pGADT7-T+pGBKT7-Lam陰性對照則沒有菌落形成。初步推測MePP2CAb與ABA信號通路上游成分MePYL1存在相互作用關(guān)系。

3??討論

UMEZAWA等[6]在擬南芥中首次確認了ABA受體及其核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括PYR/PYL/?RCARs（ABA受體）、A類PP2Cs（蛋白磷酸酶）和SnRK2s（蛋白激酶）。ABA作為植物響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵激素，使得研究A類PP2Cs基因的功能顯得十分重要。

3.1??MePP2CAb基因的結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系

本研究成功克隆了PP2C?A亞家族成員MePP2CAb基因，其位于木薯7號染色體上，并包含4個外顯子。通過與多個物種中PP2C的氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)MePP2CAb基因在C端具有保守性[9]。此外，MePP2CAb與HbPP2C和JcPP2C在親緣關(guān)系上較為接近，進一步證明MePP2CAb屬于PP2C家族基因。

3.2??MePP2CAb基因在木薯不同組織中的表達模式

木薯作為熱區(qū)的重要糧食和經(jīng)濟作物，具有耐貧瘠和抗旱的特性。ABA在植物應(yīng)對非生物逆境的過程中扮演著重要角色，而PP2C則是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心組成成分[6]。MePP2CAb基因在Agr7的根、莖和葉中的表達水平都較高，其中根中的表達水平最高，這表明MePP2CAb基因可能參與根的生長發(fā)育。有研究顯示，TaPP2C-a10和AanPP2C1基因分別在小麥和青蒿的不同組織中均有表達[30-31]。

3.3??A類PP2C基因的功能研究

已有研究表明，在擬南芥中的A類PP2C基因通常扮演負調(diào)控ABA信號的角色，其中一些基因參與氧化脅迫的響應(yīng)，而AHG3參與抗冷脅迫[32-34]。玉米中的ZmPP2CA負調(diào)控干旱，而ZmPP2C2則可增強植物的抗寒能力[23-24]。此外，水稻中的A類PP2C基因也能響應(yīng)多種非生物逆境[15]。本研究結(jié)果顯示，MePP2CAb基因可被mannitiol、NaCl、ABA和MeJA誘導(dǎo)，但受SA和低溫抑制。在擬南芥中，A類PP2C家族基因通常被視為ABA信號途徑的負調(diào)控因子，但過表達FsPP2C2和AtPP2CG1基因可增強植株對逆境脅迫的耐受能力和對ABA信號的敏感性[35-36]。上述研究揭示了A類PP2C基因在不同植物和不同逆境條件下的功能差異。通常情況下，ABA主要在植物體內(nèi)的根部和受脅迫的葉片中合成。然而，在本研究中，研究人員僅選擇了葉片樣品來檢測MePP2CAb基因的表達量，而忽略了其在根部高表達的情況，這種方法可能會限制對MePP2CAb基因在不同處理條件下表達模式的全面理解。為了更好地解釋研究結(jié)果，后續(xù)研究將對根部中MePP2CAb基因在不同處理條件下的表達模式進行分析。通過進行全面表達模式分析，可以更全面地了解MePP2CAb基因在逆境處理中的響應(yīng)，有助于揭示MePP2CAb基因在植物逆境響應(yīng)中的具體作用，并提供更準(zhǔn)確解釋相關(guān)現(xiàn)象的線索。酵母雙雜交實驗觀察到MePP2CAb與MePYL1蛋白存在互作，進一步證明MePP2CAb屬于PP2C?A亞家族并參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測MePP2CAb基因可能通過ABA信號通路響應(yīng)非生物脅迫，但其具體是正調(diào)控因子還是負調(diào)控因子尚不明確。該研究結(jié)果為進一步研究MePP2CAb基因在ABA信號通路中的作用及提高木薯在非生物脅迫中的適應(yīng)能力提供參考。

致謝??感謝李丹丹女士在論文撰寫過程中的校對工作。

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