HD-BioP3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

王亞萍，宋路萍，邢體坤，李靜波，張靜靜（通信作者）

河南晟明生物技術(shù)研究院有限公司 （河南新鄉(xiāng) 453500）

電轉(zhuǎn)染主要通過物理電流擊穿細(xì)胞膜形成瞬時(shí)孔隙，目的基因通過孔隙進(jìn)入細(xì)胞[1]，這種方法具有操作簡(jiǎn)便、毒性小、電轉(zhuǎn)染效率較高等優(yōu)點(diǎn)，其轉(zhuǎn)染效率通常在30%～90%之間[2-4]。電轉(zhuǎn)染在克隆操作以及表達(dá)中具有重要作用，因此，提升基因電轉(zhuǎn)染效率是當(dāng)前基因工作研究人員關(guān)注的重點(diǎn)問題[5]。電轉(zhuǎn)染效率受很多因素的影響，包括電轉(zhuǎn)染緩沖液[6-8]、電轉(zhuǎn)染程序[9-11]、細(xì)胞數(shù)量[12]、電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量[13-15]、電轉(zhuǎn)染前后溫度[16]等。不同的細(xì)胞系有不同的最佳電轉(zhuǎn)染條件[17]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染通常在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、PBS+蔗糖或培養(yǎng)基中進(jìn)行[18-19]。本研究分析電轉(zhuǎn)染緩沖液、電轉(zhuǎn)染溫度和電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量3 個(gè)因素對(duì)細(xì)胞活率及電轉(zhuǎn)染效率的影響，從而確定HD-BioP3 細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)染條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

HD-BioP3 細(xì)胞購自Horizon 公司；GFP 質(zhì)粒購自Lonza 公司；EX-CELL?CD CHO Fusion 培養(yǎng)基、L-Glutamine solution、蔗糖購自默克公司；CD Forti CHOTM培養(yǎng)基、PBS 購自賽默飛世爾科技公司；0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液購自Countstar 公司。

1.2 儀器

電穿孔系統(tǒng)（品牌：Bio-Rad 伯樂，型號(hào)：Gene Pulser Xcell，用于轉(zhuǎn)染每種細(xì)胞類型的模塊化電穿孔系統(tǒng)）；疊加式恒溫振蕩器（品牌：精騏，型號(hào)：IS-RDS6C，帶CO2）；二氧化碳培養(yǎng)箱（品牌：Heal Force，型號(hào)：HF90）；潔凈工作臺(tái)（品牌：蘇凈安泰，型號(hào)：SW-CJ-2FD）；電熱恒溫水浴鍋（品牌：上海一恒，型號(hào)：HWS-28）；全自動(dòng)熒光細(xì)胞分析儀（品牌：Countstar，型號(hào)：Rigel S2）；離心機(jī)（品牌：Eppendorf，型號(hào)：5804R）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染優(yōu)化前準(zhǔn)備

37 ℃水浴復(fù)蘇一支HD-BioP3 細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至1.5×106～4.0×106cells/ml 時(shí)，按0.2×106cells/ml 接種至生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含4 mmol/L L-Glutamine solution的CD Forti CHOTM培養(yǎng)基）中；電轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞以0.5×106cells/ml 接種至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為120 rpm，二氧化碳濃度為5%，溫度為37 ℃，振幅為26 mm），24 h 后用于電轉(zhuǎn)染優(yōu)化。

2.2 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染優(yōu)化

2.2.1 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染緩沖液和電轉(zhuǎn)染溫度優(yōu)化

準(zhǔn)備PBS、PBS+5%蔗糖、EX-CELL?CD CHO Fusion 培養(yǎng)基、CD Forti CHOTM培養(yǎng)基4 種介質(zhì)作為電轉(zhuǎn)染緩沖液并分別標(biāo)記為Buffer1～Buffer4 備用；取2.1 中準(zhǔn)備的細(xì)胞，將0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液按照1‥1 比例混合，采用全自動(dòng)熒光細(xì)胞分析儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果取5×106個(gè)細(xì)胞，以220 rcf 速度離心5 min，棄上清液；取電轉(zhuǎn)染緩沖液 600 μl 重懸細(xì)胞，再加入20 μg GFP 質(zhì)粒，輕輕吹打混勻細(xì)胞和質(zhì)粒轉(zhuǎn)入電擊杯，按上述步驟，Buffer1～Buffer4 各做兩組，一組于常溫條件下進(jìn)行電擊，另一組于4 ℃條件下放置5 min 后進(jìn)行電擊。電擊參數(shù)設(shè)置如下，電壓為300 V，電容為950 μF，脈沖為指數(shù)衰減，將電擊后的細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)至含預(yù)熱后的5 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的T25 方瓶中，溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，濕化過夜培養(yǎng)。

2.2.2 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量?jī)?yōu)化

根據(jù)2.2.1 選擇合適的電轉(zhuǎn)染緩沖液和電轉(zhuǎn)染溫度，在10～100 μg 之間設(shè)置10 個(gè)梯度的電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量進(jìn)行最佳電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的優(yōu)化，電擊參數(shù)設(shè)置如下，電壓為300 V，電容為950 μF，脈沖為指數(shù)衰減，將電擊后的細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)到含預(yù)熱后的5 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的T25 方瓶中，溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，濕化過夜培養(yǎng)。

2.3 分析方法

HD-BioP3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染優(yōu)化24 h 后，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液按照1‥1 比例混合，采用全自動(dòng)熒光細(xì)胞分析儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)及計(jì)數(shù)。

3 結(jié)果分析

3.1 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染緩沖液和電轉(zhuǎn)染溫度優(yōu)化結(jié)果分析

電轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果顯示，在常溫條件下Buffer1～Buffer4的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率依次為8.4%、18.8%、48.8%、22.4%，在4 ℃條件下Buffer1～Buffer4 的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率依次為20.9%、25.2%、67.3%、15.7%；Buffer1 在常溫和4 ℃條件下的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差12.5%，依次類推，Buffer1～Buffer4 在常溫和4 ℃條件下的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差在6.4%～18.5%之間；在同一溫度下，4 種電轉(zhuǎn)緩沖液的電轉(zhuǎn)染效率差距較大，在常溫條件下，Buffer2 和Buffer4 的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差3.6%，而Buffer3 和Buffer1 的細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差40.4%，因此在常溫條件下細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差3.6%～40.4%，依此類推，在4 ℃條件下細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率相差4.3%～51.6%（圖1～4）。

圖1 在常溫條件下HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染24 h 后電轉(zhuǎn)染效率

圖2 在4 ℃條件下HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染24 h 后電轉(zhuǎn)染效率

HD-BioP3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染優(yōu)化24 h 后，結(jié)果顯示，在常溫條件下，Buffer1 和Buffer3 細(xì)胞活率均＆gt;80%，Buffer4 細(xì)胞活率＆lt;60%（圖3）；在4 ℃條件下Buffer3 細(xì)胞活率＆gt;80%，Buffer1 和Buffer4 細(xì)胞活率＆lt;60%（圖4）。

圖3 常溫條件下HD-BioP3細(xì)胞在電轉(zhuǎn)緩沖液Buffer1～Buffer4中細(xì)胞活率和電轉(zhuǎn)染效率

圖4 在4 ℃條件下HD-BioP3細(xì)胞在電轉(zhuǎn)緩沖液Buffer1～Buffer4中細(xì)胞活率和電轉(zhuǎn)染效率

3.2 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量測(cè)試

根據(jù)3.1 選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活率均最高的實(shí)驗(yàn)條件，即選擇Buffer3 作為電轉(zhuǎn)染緩沖液在4 ℃條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量?jī)?yōu)化，結(jié)果顯示，隨著電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的增加，細(xì)胞活率呈逐漸下降，10～30 μg 電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量細(xì)胞活率＆gt;70%，40～70 μg 電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量細(xì)胞活率在60%～65%之間，80～100 μg 電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量細(xì)胞活率均＆lt;50%。隨著電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的增加，電轉(zhuǎn)染效率逐漸升高；電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為30 μg 時(shí)電轉(zhuǎn)染效率達(dá)到平臺(tái)期，電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量＆gt;70 μg 時(shí)電轉(zhuǎn)染效率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量不同造成電轉(zhuǎn)染效率最大相差24.6%（圖5～7）。

圖5 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染24 h 后電轉(zhuǎn)染效率

圖6 HD-BioP3細(xì)胞電轉(zhuǎn)染24 h 后電轉(zhuǎn)染效率

圖7 HD-BioP3細(xì)胞不同電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量細(xì)胞活率和電轉(zhuǎn)染效率

4 討論

電轉(zhuǎn)染是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法[20]，目的基因能否進(jìn)行表達(dá)，取決于表達(dá)目的基因能否成功進(jìn)入細(xì)胞[21]；這種電轉(zhuǎn)染方式雖然操作簡(jiǎn)單，電轉(zhuǎn)染效率高，但不合適的電轉(zhuǎn)染條件容易導(dǎo)致細(xì)胞無法形成電穿孔或死亡，造成電轉(zhuǎn)染效率下降[22]。

本研究結(jié)果顯示，在測(cè)試3 個(gè)因素對(duì)電轉(zhuǎn)效率的影響實(shí)驗(yàn)中，不同電轉(zhuǎn)染緩沖液對(duì)電轉(zhuǎn)染效率影響最大相差51.6%，其次為不同電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量，電轉(zhuǎn)質(zhì)粒量對(duì)電轉(zhuǎn)染效率影響最大相差24.6%，電轉(zhuǎn)染溫度影響較小，不同電轉(zhuǎn)染溫度對(duì)電轉(zhuǎn)染效率影響最大相差18.5%。故在EX-CELL?CD CHO Fusion 作為電轉(zhuǎn)染緩沖液、電轉(zhuǎn)染溫度為4 ℃、電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為30 μg 的條件下，電轉(zhuǎn)染效果最好。

綜上所述，優(yōu)化HD-BioP3 細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染條件，可為研究外源基因電轉(zhuǎn)染HD-BioP3 細(xì)胞提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。