氯化膽堿和蔗糖切片液制作的小鼠腦片下丘腦視前區(qū)神經(jīng)元電生理特性的比較

馬乖乖，毛宏暉，奚楷文，劉明月，肖昊翔，袁滋鐸，武勝昔，王文挺，殷松娜(延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 延安 76000；空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 7003)

下丘腦視前區(qū)(medial preoptic area of hypothalamus，mPOA)是位于下丘腦前部?jī)?nèi)側(cè)區(qū)，臨近第三腦室前部、視交叉和前連合的區(qū)域[1]。它是下丘腦一個(gè)異質(zhì)性結(jié)構(gòu)，主要由表達(dá)神經(jīng)肽甘氨酸、神經(jīng)緊張素、雌激素受體α和雄激素受體的神經(jīng)元組成，參與調(diào)節(jié)本能動(dòng)機(jī)行為如體溫、睡眠覺醒、母性行為、交配行為和攻擊性等[2]。研究表明，母鼠在接觸幼崽后mPOA神經(jīng)元C-Fos會(huì)被激活[3]。損毀mPOA包括電損毀、興奮性毒性損傷[4]、化學(xué)失活和特異性細(xì)胞消融，均會(huì)降低幼崽取回、筑巢、伏蹲等母性行為，甚至?xí)鹉甘蠊粲揍绦袨閇5]。此外，有研究提示，mPOA參與了正常疼痛及嗎啡鎮(zhèn)痛，且存在性別差異[6-7]。由于神經(jīng)元通過(guò)突觸傳遞及動(dòng)作電位等電活動(dòng)來(lái)執(zhí)行功能，因此，研究mPOA神經(jīng)元的電生理特征對(duì)于理解mPOA腦區(qū)功能至關(guān)重要。

離體腦片是研究神經(jīng)元電生理特性常用的標(biāo)本。通過(guò)對(duì)腦片上神經(jīng)元的膜片鉗記錄，還可以和細(xì)胞標(biāo)記、測(cè)序等結(jié)合同時(shí)獲得記錄神經(jīng)元形態(tài)及分子層面的數(shù)據(jù)。而離體腦片的細(xì)胞活性對(duì)于實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。腦片的制備會(huì)根據(jù)動(dòng)物年齡大小及腦區(qū)的差異有不同方法。例如，取材時(shí)為了減少細(xì)胞的耗氧量，切片液中用鈉通道不通透的一價(jià)陽(yáng)離子代替鈉離子，這樣可以降低切片創(chuàng)傷引起的細(xì)胞興奮性毒效應(yīng)，提高其活性。此外，切片時(shí)保持低溫、充分的氧飽和，可以減少細(xì)胞氧耗量、補(bǔ)充氧氣，維持細(xì)胞活性。mPOA位于下丘腦，纖維交織，其神經(jīng)元常有自發(fā)放電，這給切片帶來(lái)了很大問(wèn)題：纖維交織會(huì)增加切片時(shí)刀片對(duì)神經(jīng)元的牽拉，這種機(jī)械刺激增大了對(duì)神經(jīng)元的創(chuàng)傷。自發(fā)放電則會(huì)增加這些神經(jīng)元的氧耗量。這些因素導(dǎo)致mPOA神經(jīng)元更加不耐受切片過(guò)程。氯化膽堿切片液和蔗糖切片液是常用的兩種公認(rèn)具有細(xì)胞保護(hù)作用的切片液配方。如小鼠前扣帶皮層[8]、前額葉皮層神經(jīng)元[9]、大鼠丘腦底核等用氯化膽堿切片液后，于40倍鏡下顯示出細(xì)胞輪廓清晰，表面光滑、飽滿、有立體感。也有文獻(xiàn)使用了蔗糖切片液，如杏仁核[10]、嗅皮層[11]、前扣帶皮層[12]等也適用蔗糖切片液。對(duì)于mPOA，多篇文獻(xiàn)中使用不同濃度蔗糖切片液，如VASTAGH等[13]、HORRELL等[14]記錄超極化后電位等使用了蔗糖切片液。少部分文獻(xiàn)直接用人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)切片，如STACHNIAK等[15]、WAGNER等[16]使用腦脊液直接切片。尚未檢閱到mPOA使用氯化膽堿配方切片液的文獻(xiàn)。且鮮有研究探討這兩種切片液制備的腦片內(nèi)mPOA電生理特性的不同。因此，本實(shí)驗(yàn)基于氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA細(xì)胞膜片鉗結(jié)果的影響進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)均使用飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)內(nèi)的C57雌性小鼠(4～6周齡)，小鼠體質(zhì)量15～20 g，均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物在恒溫(24±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的動(dòng)物房中飼養(yǎng)，每籠4只，自由獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)倫理規(guī)范，并得到空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：IACUC-20220362)。

1.1.2 主要試劑和儀器 所有用于配制ACSF切片液和電極內(nèi)液的藥品均購(gòu)自Sigma公司，用于記錄興奮性微小突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs)的阻斷劑TTX購(gòu)自Tocris公司，TTX用蒸餾水配成1 mmol/L的10倍濃縮儲(chǔ)存液，于-20 ℃分裝凍存。使用時(shí)用ACSF稀釋(1 ∶1 000)。其他試劑和儀器包括950 mL/L O2、50 mL/L CO2混合氣(來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)教保處)，振動(dòng)切片機(jī)(7000 smz-2，Campden Instruments，英國(guó))、水平程控電極拉制儀(P-97，Sutter Instruments，美國(guó))，膜片鉗放大器(axon 200B amplifier，Molecilar Devices，Sunnyvale，CA，美國(guó))，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Axon Digidata 1550B，Molecular Devices)和Clampex 10.6軟件(Molecular Devices)，電動(dòng)顯微三維微操縱器(MP-285，Sutter Instrument，美國(guó))，紅外微分干涉相差顯微鏡(BX51-WI，Olympus，日本)。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)主要采取腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄。首先，用異氟醚麻醉小鼠，并用冰水混合的切片液(切片液通混合氣950 mL/L O2，50 mL/L CO2)進(jìn)行切片。其中氯化膽堿配方的切片液含有以下物質(zhì)：115 mmol/L氯化膽堿，2.5 mmol/L氯化鉀，1.25 mmol/L磷酸氫二鈉，0.5 mmol/L氯化鈣，8 mmol/L氯化鎂，26 mmol/L碳酸氫鈉，10 mmol/L葡萄糖，0.1 mmol/L VC鹽和0.4 mmol/L丙酮酸鈉(pH 7.35，滲透壓300～305 mOsm/kg)。蔗糖配方的切片液含以下物質(zhì)：194 mmol/L蔗糖，30 mmol/L氯化鈉，4.5 mmol/L氯化鉀，1.2 mmol/L磷酸氫二鈉，10 mmol/L葡萄糖，26 mmol/L碳酸氫鈉，2 mmol/L硫酸鎂，0.2 mmol/L氯化鈣(pH 7.35，滲透壓356～362 mOsm/kg)。使用振動(dòng)切片機(jī)制備含有mPOA(Bregma -0.22～0.14 mm)的冠狀切片(300 μm)。制備的腦片放入切片液并在32 ℃的水浴鍋中孵育30 min，之后將其轉(zhuǎn)入含常溫ACSF中孵育1 h后開始記錄。ACSF包括：119 mmol/L氯化鈉，2.3 mmol/L氯化鉀，1.0 mmol/L磷酸氫二鈉，26.2 mmol/L碳酸氫鈉，11 mmol/L葡萄糖，1.3 mmol/L硫酸鎂和2.5 mmol/L氯化鈣(pH 7.35，滲透壓295～300 mOsm/kg)。膜片鉗記錄液用ACSF，記錄動(dòng)作電位時(shí)電極內(nèi)液注入含以下物質(zhì)的溶液：128 mmol/L葡萄糖酸鉀，10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸，10 mmol/L磷酸肌酸鈉鹽，1.1 mmol/L EGTA，5 mmol/L 三磷酸腺苷鎂鹽和0.4 mmol/L 三磷酸鳥苷鈉鹽(pH 7.35，滲透壓300～305 mOsm/kg)。記錄mEPSCs時(shí)所用電極內(nèi)液含以下物質(zhì)：107 mmol/L甲磺酸銫，10 mmol/L氯化銫，3.7 mmol/L氯化鈉，5 mmol/L 四乙胺，20 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸，0.2 mmol/L乙二醇雙四乙酸，5 mmol/L氯化利多卡因，4 mmol/L三磷酸腺苷鎂鹽，0.3 mmol/L三磷酸鳥苷鈉鹽(pH 7.35，滲透壓298～300 mOsm/kg)。電極電阻3～5 MΩ，使用膜片鉗放大器，以5 kHz濾波并使用數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Digidata 1550B, Molecular Devices)以20 kHz采樣率進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)到電腦中。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA神經(jīng)元被動(dòng)膜特性的影響

將腦片轉(zhuǎn)移至記錄槽中，用U型鉑金框固定腦片，在5倍鏡下以前連合、第三腦室和中縫為標(biāo)志定位mPOA，觀察到mPOA細(xì)胞多呈卵圓形，蔗糖切片液細(xì)胞多扁平，氯化膽堿切片液細(xì)胞立體飽滿(圖1A)。接著我們采用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗模式記錄這兩組細(xì)胞的內(nèi)在興奮性。結(jié)果顯示，氯化膽堿組細(xì)胞靜息膜電位呈去極化狀態(tài)，記錄了20個(gè)細(xì)胞，其中有13個(gè)靜息膜電位在-40 mV以上(未計(jì)入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中)，選擇膜電位負(fù)于-40 mV的7個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。蔗糖切片液細(xì)胞總記18個(gè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，氯化膽堿切片液記錄靜息膜電位較蔗糖切片液的細(xì)胞更加去極化[氯化膽堿(-45.00±3.07)mVvs蔗糖(-56.40±3.07)mV，P<0.01，圖1B]。此外，本研究也比較了兩組細(xì)胞的膜電容和膜電阻，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯的差異(圖1C～D)。

A：左側(cè)圖為低倍鏡下mPOA腦區(qū)在腦片中的位置及臨近參考解剖學(xué)標(biāo)志，中間圖為40倍鏡下電極記錄的一個(gè)蔗糖切片液制作mPOA神經(jīng)元的典型圖，右側(cè)圖為40倍鏡下電極記錄的一個(gè)氯化膽堿切片液制作mPOA神經(jīng)元的典型圖；mPOA：下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)；3V：第三腦室；aca：前連合，在mPOA上方，低倍鏡下顯示黑色陰影的地方；B：兩組切片液腦片記錄mPOA神經(jīng)元的靜息膜電位的比較， bP<0.01 vs 氯化膽堿組；C：兩組切片液腦片記錄的mPOA神經(jīng)元膜電阻的比較；D：兩組切片液腦片記錄mPOA神經(jīng)元的膜電容的比較。蔗糖組n=18個(gè)細(xì)胞；氯化膽堿組n=7個(gè)細(xì)胞。圖1 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA神經(jīng)元被動(dòng)膜特性的影響

2.2 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA主動(dòng)膜特性的影響

本研究對(duì)兩組細(xì)胞的主動(dòng)膜特性進(jìn)行了比較。細(xì)胞在電流鉗模式下，給予-100～480 pA 以“20 pA”為步階的方波刺激。圖2A展示了兩個(gè)典型細(xì)胞對(duì)方波刺激的反應(yīng)，可見示例的蔗糖組細(xì)胞靜息膜電位是-60 mV，給予20 pA的方波刺激后，該神經(jīng)元產(chǎn)生了4個(gè)放電，幅度較高，并可觀察到較深的超極化后電位，而氯化膽堿組的示例細(xì)胞靜息膜電位僅有-50 mV，同樣給予20 pA方波刺激僅僅誘發(fā)出一個(gè)動(dòng)作電位，且幅度較低，超極化后電位也比較小。研究組統(tǒng)計(jì)了兩組細(xì)胞的主動(dòng)膜特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔗糖組細(xì)胞產(chǎn)生首個(gè)動(dòng)作電位的基強(qiáng)度明顯更小[氯化膽堿(57.10±11.14)pAvs蔗糖(24.40±11.14)pA，P<0.01，圖2B]，但兩組細(xì)胞動(dòng)作電位閾值基本沒有差異(圖2C)，而蔗糖組動(dòng)作電位的幅度明顯更高[氯化膽堿(48.10±6.70)mVvs蔗糖(91.90±6.70)mV，P<0.01，圖2D]，動(dòng)作電位的半寬則明顯比氯化膽堿組小[氯化膽堿(2.50±0.25)msvs蔗糖(1.10±0.25)ms，P<0.01，圖2E]。

A：氯化膽堿和蔗糖切片液獲得的腦片典型mPOA細(xì)胞在相同去極化方波刺激下產(chǎn)生動(dòng)作電位比較；B：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動(dòng)作電位基強(qiáng)度的比較；C：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動(dòng)作電位閾值的比較；D：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動(dòng)作電位幅度的比較；E：兩種液體制作腦片記錄的細(xì)胞動(dòng)作電位半寬的比較。 bP<0.01 vs 氯化膽堿組。蔗糖組n=18個(gè)細(xì)胞；氯化膽堿組n=7個(gè)細(xì)胞。圖2 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA主動(dòng)膜特性的影響

本研究還觀察了兩組細(xì)胞重復(fù)放電的比較。分析了兩組細(xì)胞在接收刺激強(qiáng)度為20～200 pA 方波刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的幅度和個(gè)數(shù)。在注入80 pA的電流刺激時(shí)蔗糖切片液腦片的細(xì)胞可見首個(gè)動(dòng)作電位幅度最高，后續(xù)的動(dòng)作電位幅度依次降低。這個(gè)特點(diǎn)在氯化膽堿組也能觀察到。同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)蔗糖組的動(dòng)作電位幅度仍然高于氯化膽堿組(圖3A)。研究組計(jì)算了兩組神經(jīng)元在每條方波刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的平均幅度，可見氯化膽堿切片液和蔗糖切片液腦片的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环染S刺激強(qiáng)度增加逐漸遞減，但蔗糖切片液幅度一直高于氯化膽堿切片液(P<0.01，圖3B)。此外，隨著刺激強(qiáng)度的遞增，蔗糖切片液腦片的細(xì)胞放電個(gè)數(shù)先增多而后逐漸遞減至平穩(wěn)，而氯化膽堿切片液從開始的最高逐漸下降至趨于穩(wěn)定，但其放電數(shù)目明顯少于蔗糖組(P<0.05，圖3C)。

A：氯化膽堿切片液和蔗糖切片液中記錄動(dòng)作電位在注入刺激強(qiáng)度為80 pA時(shí)的示意圖；B：蔗糖和氯化膽堿切片液在不同刺激強(qiáng)度下的平均幅度， bP<0.01 vs 氯化膽堿組；C：注入不同強(qiáng)度電流刺激所激發(fā)的放電個(gè)數(shù)， aP<0.05 vs 氯化膽堿組。蔗糖組n=18個(gè)細(xì)胞，氯化膽堿組n=7個(gè)細(xì)胞。圖3 氯化膽堿組和蔗糖組在注入不同強(qiáng)度刺激電流時(shí)的幅度及放電個(gè)數(shù)

2.3 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA突觸傳遞的影響

本研究觀察了兩組神經(jīng)元興奮性突觸傳遞差異。利用CsMeSO3內(nèi)液，在電壓鉗模式下記錄兩組腦片mPOA神經(jīng)元的mEPSCs。結(jié)果顯示，蔗糖組神經(jīng)元記錄到的mEPSCs的放電個(gè)數(shù)低于氯化膽堿組(圖4A)。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證實(shí)蔗糖切片液mEPSCs放電頻率明顯低于氯化膽堿切片液[氯化膽堿(0.40±0.05)Hzvs蔗糖(0.20±0.05)Hz，P<0.05，圖4B]，放電幅度相對(duì)較低但無(wú)明顯差異(圖4C)。我們認(rèn)為，這可能與氯化膽堿切片液對(duì)mPOA上游腦區(qū)的神經(jīng)元活性保持較好有關(guān)。這體現(xiàn)在蔗糖組mEPSCs的改變主要是頻率而幅度無(wú)差異。此外，我們也隨機(jī)記錄了數(shù)個(gè)ACC腦區(qū)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在氯化膽堿切片液中狀態(tài)較好而在蔗糖切片液中細(xì)胞狀態(tài)較差。

A：氯化膽堿和蔗糖切片液制作腦片mPOA神經(jīng)元mEPSCs 10 s示例記錄圖，其中放大部位為1 s示意圖；B～C：兩種切片液制作腦片記錄的mPOA神經(jīng)元的mEPSCs頻率和振幅。mEPSCs：興奮性微小突觸后電流。 aP<0.05 vs氯化膽堿組。每組n=8個(gè)細(xì)胞。圖4 氯化膽堿切片液和蔗糖切片液對(duì)mPOA突觸傳遞的影響

3 討論

本研究比較了氯化膽堿切片液、蔗糖切片液制備腦片中mPOA腦區(qū)神經(jīng)元電生理特性的差異，發(fā)現(xiàn)蔗糖切片液能夠較好地維持mPOA神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性，而氯化膽堿切片液則對(duì)其突觸特性研究更為適合。mPOA作為下丘腦的一個(gè)核團(tuán)，參與了母性行為[17]、交配行為、攻擊行為[18-21]等，還參與了疼痛的調(diào)控。其發(fā)揮作用與其表達(dá)的多種激素及激素受體，如雌激素、催乳素、催產(chǎn)素[22-25]等有密切關(guān)系。為了更好地研究這些激素和受體對(duì)mPOA神經(jīng)元的影響，通過(guò)離體腦片進(jìn)行膜片鉗記錄是一個(gè)重要途徑。由于mPOA區(qū)域纖維眾多，且mPOA神經(jīng)元常有自發(fā)放電。因此，在離體腦片制備過(guò)程中保持mPOA腦區(qū)神經(jīng)元活性，特別是成年小鼠的神經(jīng)元，相對(duì)比較困難，僅用ACSF進(jìn)行切片很難滿足要求。這個(gè)時(shí)候通常需要利用替代ACSF的鈉離子方法來(lái)降低切片對(duì)神經(jīng)元的損傷。氯化膽堿和蔗糖是兩種常用的方法。我們觀察到的氯化膽堿切片液對(duì)于mPOA神經(jīng)元興奮性影響的具體機(jī)制還不清楚，我們推測(cè)這可能與膽堿和mPOA神經(jīng)元上某種受體相互作用有關(guān)。在氯化膽堿切片液中是用膽堿替換鈉離子，這在記錄鈉通道電流中是一種常用的方法。研究表明，膽堿并不是簡(jiǎn)單的一價(jià)陽(yáng)離子，它可看作是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在某些食物中天然存在。在體內(nèi)，哺乳動(dòng)物通過(guò)甲基化磷脂酰乙醇胺和水解所得磷脂酰膽堿來(lái)合成膽堿。通常腦內(nèi)膽堿濃度高于血漿濃度，但由于血腦屏障運(yùn)輸系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)特性，當(dāng)膽堿能神經(jīng)元被激活時(shí)，乙酰膽堿的釋放可以通過(guò)增加血漿膽堿的方式來(lái)增強(qiáng)腦內(nèi)膽堿濃度[26]。因膽堿和乙酰輔酶A能夠合成乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh，一種重要的神經(jīng)遞質(zhì))，同理ACh通過(guò)水解后得到膽堿[27]。因此，膽堿切片液中高濃度的膽堿可能會(huì)影響到ACh代謝途徑從而影響到神經(jīng)元的電生理特性。蔗糖切片液的主要成分是蔗糖，蔗糖相對(duì)于葡萄糖結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，也作為離體腦片ACSF鈉離子替代物的一種。這種方法也是離體腦片常用的方法。這種方法對(duì)于mPOA腦區(qū)來(lái)看，對(duì)興奮性的維持明顯好于氯化膽堿。這主要與它除了給予細(xì)胞所需要的碳和能量外還可以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定，且較少影響到細(xì)胞膜上的受體有關(guān)。然而，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，蔗糖切片液相對(duì)于氯化膽堿切片液，在許多腦區(qū)腦片細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)上并不夠好。例如，我們發(fā)現(xiàn)，在成年丘腦底核的腦片制備上，氯化膽堿切片液可以達(dá)到較好的效果[28]。而對(duì)于突觸傳遞，突觸前神經(jīng)元的活性維持至關(guān)重要。對(duì)于突觸后神經(jīng)元，為了減少空間鉗的影響，通常記錄突觸活動(dòng)采用的銫為內(nèi)液的主離子。這種內(nèi)液雖然增強(qiáng)了mEPSCs沿樹突傳遞的空間時(shí)間常數(shù)，但由于其主離子并不是生理性液體的K+。因此，相對(duì)于神經(jīng)元興奮性，膽堿對(duì)mEPSCs的影響可能不如對(duì)興奮性影響那么顯著。但是，我們?nèi)匀徊荒芘懦@個(gè)可能性，還有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，雖然氯化膽堿切片液和蔗糖切片液均可使mPOA內(nèi)神經(jīng)元存活，但兩種切片液對(duì)于mPOA神經(jīng)元電生理特性影響具有不同：蔗糖切片液制作的腦片更適合mPOA神經(jīng)元興奮性的記錄，氯化膽堿對(duì)mPOA細(xì)胞的影響因素需要進(jìn)一步探究。