• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    苗藥五藤膏外敷對膝骨關節(jié)炎兔模型的治療作用及機制

    2023-03-17 14:14:42韓珊周靜馬武開肖麗娜姚血明唐芳申海艷陳琳王顏君
    山東醫(yī)藥 2023年7期
    關鍵詞:苗藥巴布空白對照

    韓珊,周靜,馬武開,肖麗娜,姚血明,唐芳,申海艷,陳琳,王顏君

    1 貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,貴陽 550001;2 貴州省骨科醫(yī)院疼痛科;3 貴州中醫(yī)藥大學研究生院

    膝骨關節(jié)炎(KOA)是一種慢性退行性骨關節(jié)疾病,患病率與年齡呈正相關。據(jù)不完全統(tǒng)計,40歲以上人群患病率10%~17%,60 歲以上患病率為50%以上[1]。該病以關節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要病理特征,主要臨床表現(xiàn)為進行性膝關節(jié)疼痛、腫脹、活動受限及畸形[2]。其臨床治療主要以迅速有效緩解疼痛為主,包括藥物治療、運動治療、手術治療等,其中藥物治療不良反應多,易反復發(fā)作;運動治療適應證較少,患者依從性差;手術治療易發(fā)生感染、神經(jīng)損傷、關節(jié)活動障礙等并發(fā)癥[3]。隨著祖國醫(yī)學的不斷發(fā)展,苗醫(yī)藥治療KOA有極大優(yōu)勢,其中尤以外治法為精。苗醫(yī)學主張“壅塞為病,通達為康”“身不通則痛”,認為冷風毒壅塞筋脈是形成KOA 的主要原因,治療應以“通筋散血”為主[4]。苗藥五藤膏有祛風通絡、活血止痛等功效,前期臨床研究證實該藥能有效緩解KOA患者關節(jié)疼痛、腫脹、僵硬等臨床癥狀[5-6]。相關研究認為,KOA 的病理改變主要與軟骨降解、骨贅形成及軟骨下骨改變相關,涉及Wnt、Notch 等多條信號轉(zhuǎn)導途徑。其中Wnt 信號作為調(diào)節(jié)軟骨細胞代謝,維持成骨細胞和破骨細胞平衡的重要途徑,其關鍵酶GSK-3β 可直接磷酸化樞紐蛋白β-catenin 來激活Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導途徑,繼而促進軟骨細胞、滑膜細胞、成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、骨保護素(OPG),使軟骨細胞外基質(zhì)(ECM)發(fā)生降解和骨形成,引起關節(jié)軟骨和軟骨下骨進行性破環(huán),KOA 形成;而Notch 信號作為調(diào)控軟骨細胞分化、發(fā)育的重要途徑,通過生成胞內(nèi)區(qū)與細胞核中DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合后激活下游靶基因(Notch1 等)相關蛋白發(fā)揮作用[7-9]。研究表明,Notch1 蛋白是導致KOA 的常見信號通路效應蛋白[10]。2020 年6 月—11 月,本研究在前期研究基礎上,觀察五藤膏外敷干預對KOA 兔模型的治療作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1 動物、試劑及儀器 選取4~5月齡普通級健康家兔96 只,雌雄各半,體質(zhì)量(2.0 ± 0.5)kg,由貴州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供,動物合格證號:SCXK(黔)2018-00012。飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學動物實驗中心動物房,每籠1 只,房內(nèi)保持恒溫,明暗光線交替(12 h/12 h),實驗前均適應性喂養(yǎng)1 周。在實驗過程中遵照實驗動物倫理要求。

    苗藥五藤膏由貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供(黔藥制字Z20120072)。氟比洛芬巴布膏(日本三笠制藥株式會社,規(guī)格:40 mg/貼);TRIzol(美國Ambion 公司)、HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、5×HiScript Buffer(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、Ribonuclease Inhibitor(北京全式金生物技術股份有限公司)、DL2000 DNA Marker[天根生化科技(北京)有限公司]。

    實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)、微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表有限公司)、pH 計(德國Metter-Toledo GmbH 公司)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。

    1.2 動物分組及模型制備 采用隨機數(shù)字表法將96 只家兔分為空白對照組、模型組、巴布膏組及五藤膏低、中、高劑量組,每組16 只。除空白對照組外,其余組分別于第1、4、7天給予4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 mL注入兔右膝關節(jié)腔內(nèi),制備KOA模型[11]。第7 天注射完畢后,不再進行任何干預,繼續(xù)正常飼養(yǎng)4周。

    1.3 藥物干預與標本獲取 家兔藥物使用劑量均按標準換算成人體等效劑量[12]。造模第6 周,空白對照組、模型組每日給予無菌紗布包扎固定右膝關節(jié)4 h。巴布膏組給予氟比洛芬巴布膏(4 cm×3 cm)貼敷于兔右膝關節(jié)前方,苗藥五藤膏低、中、高劑量組分別給予1、2、4 g五藤膏(4 cm×3 cm)貼敷于兔右膝關節(jié)前方,貼敷前用動物專用剃毛器剃除兔膝關節(jié)周圍白毛,均用繃帶包扎固定4 h,每日給藥1 次,干預4 周。分別于給藥1、2、3、4 周每組各取4 只家兔,采用空氣栓塞法處死,暴露其右側(cè)膝關節(jié),取右側(cè)股骨內(nèi)髁頂點鈣化層以上軟骨。

    1.4 觀察指標與方法

    1.4.1 膝關節(jié)軟骨組織病理學變化觀察 暴露右膝關節(jié)軟骨后,肉眼觀察關節(jié)軟骨表面,然后取股骨內(nèi)髁頂點鈣化層以上軟骨制作病理標本,經(jīng)中性甲醛固定、硝酸脫鈣、常規(guī)石蠟包埋、切片及HE 染色后,觀察軟骨組織形態(tài)變化。采用Mankin's 評分[13]評價膝關節(jié)軟骨組織病理學改變程度,包括軟骨組織結(jié)構(gòu):①光滑正常計0 分;②表面不規(guī)則裂隙,排列紊亂,但層次可計1 分;③排列明顯不規(guī)則,層次紊亂計2分;④嚴重紊亂,裂隙深達輻射層計3分;⑤裂隙達鈣化層計4分;⑥軟骨層脫落計5分。細胞數(shù)量:①正常計0分;②數(shù)量彌漫性增多計1分;③出現(xiàn)簇集樣細胞團計2分;④數(shù)量明顯減少計3分。潮線完整性:①完整計0 分;②多層次計1 分;③模糊計2分;④有血管穿過計3分。

    1.4.2 膝關節(jié)軟骨組織中Wnt/β-catenin 信號通路下游靶基因GSK-3β、MMP-3、OPG及Notch信號通路下游靶基因Notch1 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol 法提取樣本總RNA:按照試劑盒說明書要求,取-80 ℃冰箱中凍存軟骨組織100 mg,剪碎并加入TRIzol試劑進行研磨、裂解及離心;加入氯仿并以12 000 r/min離心15 min,離心半徑為13.5 cm;將上層RNA 轉(zhuǎn)至另一含異丙醇的EP 管中靜置、離心,管底可見白色RNA 沉淀;棄上清液,加入無RNase 的75% 乙 醇1 mL,以1 000 r/min,離 心5 min;重復以上步驟1 次,將干燥RNA 沉淀溶于20 μL DEPC 水中,計算RNA 濃度,并將所得cDNA稀釋4 倍進行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄反應體系:cDNA 4 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL、H2O 4.8 μL。反應條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。繪制溶解曲線,以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。以β-actin 為內(nèi)參,GSK-3β、MMP-3、OPG、Notch1 引物由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司設計與合成,見表1。

    表1 基因引物序列

    1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示,多組比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;不同時間點比較采用重復測量方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組關節(jié)軟骨組織病理變化比較 空白對照組關節(jié)軟骨表面光滑平整,結(jié)構(gòu)清晰,軟骨細胞數(shù)目多且分布均勻,潮線識別度清晰,未發(fā)生變性、萎縮。模型組關節(jié)軟骨表面粗糙不平整,結(jié)構(gòu)模糊,軟骨細胞數(shù)目少且分布紊亂,潮線識別度模糊,重度變性、萎縮。各治療組軟骨組織破壞程度、軟骨細胞分布排列及潮線識別度等均低于模型組、高于空白對照組;五藤膏高劑量組關節(jié)軟骨表面較光滑平整,結(jié)構(gòu)較清晰,軟骨細胞數(shù)目較多且分布較均勻,潮線識別度較好,發(fā)生輕度變性、萎縮;而苗藥五藤膏低、中劑量組及巴布膏組伴不同程度的關節(jié)腫脹及滑膜充血,層次結(jié)構(gòu)較模糊,軟骨細胞數(shù)量較少且分布輕度紊亂,個別潮線識別度模糊,發(fā)生中度變性、萎縮。空白對照組、模型組、五藤膏低劑量組、五藤膏中劑量組、五藤膏高劑量組、巴布膏組膝關節(jié)軟骨組織Mankin's 評分分別為(0.91 ± 0.74)、(13.20 ± 1.15)、(7.70 ± 0.60)、(4.70 ± 0.62)、(3.33 ± 0.68)、(4.60 ± 0.78)分。與空白對照組比較,模型組膝關節(jié)軟骨組織Mankin's 評分高(P<0.05);與模型組比較,各治療組Mankin's 評分低(P均<0.05),且五藤膏高劑量組Mankin's 評分最低(P均<0.05)。

    葉頂汽封運行中即使與覆環(huán)碰磨,也不會造成轉(zhuǎn)子熱彎,振動理論認為,一般不會引起碰磨振動。但嚴重的碰磨會在覆環(huán)上留下非常顯著的劃傷,同樣也是不能接受的。刷式汽封及蜂窩汽封與轉(zhuǎn)子碰磨時對轉(zhuǎn)子的損傷較輕,尤其是蜂窩汽封基本上不會磨傷轉(zhuǎn)子。而且兩種汽封都具備比較耐磨的特點。因此,更適用于直徑大線速度比隔板汽封高的葉頂汽封。

    2.2 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中GSK-3β mRNA表達比較 見表2。

    表2 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中GSK-3β mRNA表達比較( ± s)

    表2 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中GSK-3β mRNA表達比較( ± s)

    注:與空白對照組同期比較,aP<0.05;與模型組同期比較,bP<0.05;與巴布膏組同期比較,cP<0.05;苗藥五藤膏組組內(nèi)各時點比較,dP<0.05。

    組別空白對照組模型組五藤膏低劑量組五藤膏中劑量組五藤膏高劑量組巴布膏組n 4 4 4 4 4 4 GSK-3β mRNA干預1周1.000 ± 0.189 5.601 ± 0.936a 3.743 ± 0.736bc 2.653 ± 0.473bd 1.994 ± 0.490bd 1.956 ± 0.288b干預2周1.205 ± 0.242 5.667 ± 0.870a 3.746 ± 0.433bc 2.755 ± 0.606b 2.059 ± 0.337bd 1.893 ± 0.345b干預3周1.022 ± 0.016 6.625 ± 0.088a 3.671 ± 0.498bc 2.838 ± 0.808bd 2.016 ± 0.749bd 1.909 ± 0.497b干預4周1.076 ± 0.113 5.964 ± 0.573a 3.828 ± 1.040bc 2.599 ± 0.836bd 2.004 ± 0.247bd 1.690 ± 0.223b

    2.3 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中MMP-3 mRNA 表達比較 見表3。

    表3 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中MMP-3 mRNA表達比較(±s)

    表3 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中MMP-3 mRNA表達比較(±s)

    注:與空白對照組同期比較,aP<0.05;與模型組同期比較,bP<0.05;與巴布膏組同期比較,cP<0.05;苗藥五藤膏組組內(nèi)各時點比較,dP<0.05。

    組別空白對照組模型組五藤膏低劑量組五藤膏中劑量組五藤膏高劑量組巴布膏組n 4 4 4 4 4 4 MMP-3 mRNA干預1周1.000 ± 0.151 5.275 ± 1.233a 5.136 ± 0.510c 4.406 ± 0.395bc 3.483 ± 1.017bd 3.320 ± 0.501b干預2周1.167 ± 0.016 5.889 ± 0.619a 4.533 ± 0.535bc 3.552 ± 0.276bd 2.763 ± 0.286bd 2.906 ± 0.413b干預3周0.970 ± 0.181 6.509 ± 0.490a 3.673 ± 0.467b 2.963 ± 0.579bd 2.120 ± 0.243bd 2.144 ± 0.309b干預4周1.045 ± 0.106 5.891 ± 0.617a 4.007 ± 0.440b 3.351 ± 0.465bd 2.461 ± 0.398bd 2.644 ± 0.299b

    2.4 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中OPG mRNA表達比較 見表4。

    表4 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中OPG mRNA表達比較(±s)

    表4 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中OPG mRNA表達比較(±s)

    注:與空白對照組同期比較,aP<0.05;與模型組同期比較,bP<0.05;與巴布膏組同期比較,cP<0.05;苗藥五藤膏組組內(nèi)各時點比較,dP<0.05。

    組別空白對照組模型組五藤膏低劑量組五藤膏中劑量組五藤膏高劑量組巴布膏組n 4 4 4 4 4 4 OPG mRNA干預1周1.000 ± 0.163 0.384 ± 0.016a 0.437 ± 0.061bc 0.580 ± 0.243bd 0.765 ± 0.223bd 0.751 ± 0.188b干預2周1.024 ± 0.139 0.353 ± 0.047a 0.412 ± 0.068bc 0.593 ± 0.164bd 0.754 ± 0.106bd 0.793 ± 0.147b干預3周1.178 ± 0.015 0.249 ± 0.151a 0.475 ± 0.110bc 0.589 ± 0.130bd 0.725 ± 0.249bd 0.777 ± 0.123b干預4周1.067 ± 0.096 0.329 ± 0.071a 0.490 ± 0.115bc 0.586 ± 0.086bd 0.799 ± 0.169bd 0.788 ± 0.165b

    2.5 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中Notch1 mRNA表達比較 見表5。

    表5 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中Notch1 mRNA表達比較(±s)

    表5 各組不同時點膝關節(jié)軟骨組織中Notch1 mRNA表達比較(±s)

    注:與空白對照組同期比較,aP<0.05;與模型組同期比較,bP<0.05;與巴布膏組同期比較,cP<0.05;苗藥五藤膏組組內(nèi)各時點比較,dP<0.05。

    組別空白對照組模型組五藤膏低劑量組五藤膏中劑量組五藤膏高劑量組巴布膏組n 4 4 4 4 4 4 Notch1 mRNA干預1周1.000 ± 0.364 5.285 ± 0.744a 4.584 ± 0.582bc 4.364 ± 0.631bc 3.909 ± 0.403b 3.601 ± 0.542b干預2周1.239 ± 0.125 6.100 ± 0.071a 4.379 ± 0.231bc 4.034 ± 0.361b 3.435 ± 0.369b 3.252 ± 0.412b干預3周1.334 ± 0.030 5.063 ± 0.966a 3.846 ± 0.314b 3.531 ± 0.306b 2.762 ± 0.183bd 2.681 ± 0.506b干預4周1.191 ± 0.172 5.483 ± 0.546a 3.167 ± 0.566b 2.926 ± 0.471bd 2.268 ± 0.367b 2.227 ± 0.345b

    3 討論

    KOA 是導致老年人行動障礙的重要疾病之一,隸屬中醫(yī)“痹癥”之“骨痹、膝痹”范疇,在苗醫(yī)學中稱“冷骨風”,以關節(jié)軟骨變性、退化及骨質(zhì)增生為主要特征[14]。關節(jié)軟骨作為骨關節(jié)炎病變的主要部位,由1%的軟骨細胞和99%的ECM 組成,其中占比較大的ECM 賦予了關節(jié)軟骨張力、彈性及分散、吸收關節(jié)處負荷的能力。研究表明,一旦關節(jié)軟骨遭受損傷時,軟骨下骨也會因此而發(fā)生相應的力學改變,繼而使軟骨細胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)移,骨轉(zhuǎn)換失衡,骨重塑異常,最終干擾關節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),減弱軟骨支撐作用和保護機制,加速骨關節(jié)退變,導致骨關節(jié)炎發(fā)生[15]。KOA 作為臨床最為常見的骨關節(jié)炎,近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨細胞、ECM、成骨細胞及破骨細胞導致的軟骨細胞破壞、軟骨基質(zhì)過度降解及骨重塑異常與其發(fā)病密切相關。此過程涉及多條信號通路,其中以Wnt和Notch信號通路研究較為廣泛。Wnt、Notch 信號通路在KOA 患者軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等骨性細胞分化、增殖及凋亡,維持軟骨細胞表型及基質(zhì)代謝平衡等方面發(fā)揮重要作用[13,16]。

    Notch信號通路是一條影響細胞命運、進化上高度保守的跨膜信號轉(zhuǎn)導通路,普遍存在于脊椎和無脊椎動物體中,由4 種受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、5 種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)及轉(zhuǎn)錄因子CSL 組成[20]。兩個相鄰細胞的Notch 受體與配體相互作用激活Notch 信號通路,激活后的Notch 信號通路可參與調(diào)控軟骨細胞的形成、增殖、分化及凋亡過程。研究表明,Notch信號通路在骨關節(jié)炎中具有保護和破壞雙重調(diào)節(jié)作用,即:抑制Notch 信號會導致關節(jié)軟骨細胞的增殖、肥大,促進Notch 信號則能增加關節(jié)軟骨基質(zhì)的合成從而抑制關節(jié)軟骨的退變[21]。Notch1 作為Notch 信號通路中研究最為廣泛的受體,其在KOA 中的作用機制目前尚未闡明,但有研究認為異常激活的Notch1 蛋白可持續(xù)刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子,從而導致骨贅增加和骨代謝平衡能力下降[22-23],由此我們推測Notch1 可能在KOA 關節(jié)軟骨病理破壞過程中發(fā)揮重要作用。

    苗藥五藤膏是治療KOA 的外治經(jīng)驗方,方中黑骨藤祛風通絡止痛為君藥;青風藤、香血藤祛風除濕活絡為臣藥;大血藤、絡石藤祛風通絡、敗毒活血、涼血消腫為佐藥;加少許冰片透邪、起透皮作用為使藥。諸藥合用,共奏活血化瘀、消腫止痛、祛風通絡之效[24]。本研究發(fā)現(xiàn),GSK-3β、MMP-3、Notch1 mRNA表達趨勢一致,均于模型組中最高,空白對照組中最低;而OPG mRNA表達則于空白對照組中最高,模型組中最低。說明GSK-3β、MMP-3、OPG及Notch1 mRNA表達可能與KOA 的發(fā)生發(fā)展密切相關。與模型組比較,苗藥五藤膏及巴布膏組不同時間段GSK-3β、MMP-3、Notch1 mRNA 表達均降低,OPG mRNA 表達則升高,且不同劑量的苗藥五藤膏外敷干預與GSK-3β、MMP-3、Notch1 mRNA 表達呈負相關,而與OPG mRNA 表達則呈正相關,說明苗藥五藤膏可能通過促進兔關節(jié)軟骨組織中OPG mRNA 表達,抑制GSK-3β、MMP-3、Notch1 mRNA 表達,來延緩疾病進展及軟骨、軟骨下骨病變程度,從而起到治療KOA的作用。

    本研究初步證明苗藥五藤膏可通過調(diào)控Wnt/β-catenin、Notch信號通路下游靶基因治療KOA。但在研究過程中,因?qū)嶒灄l件受限,樣本量較少,未對Notch 信號通路其他基因如Notch2 受體、Notch3 受體、DLL3 配體等及Wnt/β-catenin 信號通路其他基因runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2、Ⅱ型膠原、軸蛋白等進一步研究,這將是未來研究的方向。

    猜你喜歡
    苗藥巴布空白對照
    苗藥“活絡湯”熏蒸治療類風濕性關節(jié)炎的臨床治療效果觀察
    苗藥痛風方聯(lián)合西藥治療痛風性關節(jié)炎的臨床觀察
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學中的應用
    苗藥阿銳布提取物對實驗性小鼠急性肝損傷的保護作用
    過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    復方青風藤巴布劑基質(zhì)處方的優(yōu)化
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:51
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    8 種外源激素對當歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    溫經(jīng)止痛巴布劑對痛經(jīng)模型小鼠的影響
    揮發(fā)油包合對溫臍巴布劑質(zhì)量的影響
    中成藥(2014年10期)2014-02-28 22:29:21
    丁青县| 琼海市| 高阳县| 鄱阳县| 扎兰屯市| 利辛县| 丹寨县| 台中县| 瓦房店市| 临清市| 南汇区| 赤城县| 健康| 金昌市| 皋兰县| 永胜县| 柘城县| 台南县| 黔南| 岑巩县| 西昌市| 四平市| 阿拉善左旗| 龙海市| 沛县| 桃园市| 辽源市| 新民市| 留坝县| 孟村| 新田县| 周宁县| 苍山县| 观塘区| 浙江省| 禹城市| 会宁县| 桃园县| 黄陵县| 镇巴县| 广德县|