烏頭湯調(diào)控lncRNA GAS5抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究

涂海水　邱志偉　金靈璐　鄭志煌　李瑩瑩　陳毅濤　李超　付長(zhǎng)龍

【摘 要】目的：探討烏頭湯調(diào)控lncRNA GAS5進(jìn)而干預(yù)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的效果及機(jī)制，為烏頭湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠10只，提取大鼠雙膝關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)行體外軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，采用Ⅱ型膠原免疫組化法對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定；經(jīng)10 ng·mL^-1IL-1β干預(yù)24 h誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變。將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（10 ng·mL^-1IL-1β）和烏頭湯組（150 μg·mL^-1烏頭湯水提物）。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5的相對(duì)表達(dá)水平。免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）的熒光表達(dá)量。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組lncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01），TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5熒光表達(dá)增強(qiáng)；與模型對(duì)照組比較，烏頭湯組lncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P < 0.01），TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5熒光表達(dá)顯著減弱。結(jié)論：烏頭湯可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，與調(diào)控lncRNA GAS5相對(duì)水平表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；烏頭湯；炎癥反應(yīng)；軟骨細(xì)胞外基質(zhì)；大鼠

Study on the Effect of Wutou Tang（烏頭湯）on lncRNA GAS5 Inhibiting the Inflammatory Reaction of Chondrocytes in Osteoarthritis

TU Hai-shui，QIU Zhi-wei，JIN Ling-lu，ZHENG Zhi-huang，LI Ying-ying，CHEN Yi-tao，LI Chao，F(xiàn)U Chang-long

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect and mechanism of chondrocyte inflammatory reaction of Wutou Tang（烏頭湯）on the regulation of lncRNA GAS5 and the intervention of interleukin-1β（IL-1β），provide experimental basis for clinical application of aconite soup.Methods：Ten SPF grade SD male rats at the age of?4 weeks were used to extract the articular cartilage of both knees of the rats and isolate and culture the chondrocytesin vitro.The chondrocytes were identified by typeⅡ collagen immunohistochemistry.After 10 ng·mL-1 IL-1β?intervention for 24 hours induced chondrocyte degeneration.Chondrocytes were randomly divided into blank?control group and model control group（10 ng·mL-1 IL-1β）and aconite soup group（150 μg·mL-1）.The relative expression level of lncRNA GAS5 in chondrocytes of each group was detected by Real-time PCR.The expression of?TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5 in chondrocytes was detected by immunofluorescence staining.Results：Compared with the blank control group，the relative expression level of lncRNA GAS5 in the model control group was significantly?higher（P < 0.01）.The fluorescence?expression of TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5was enhanced.Compared with the model control group，the relative expression level of lncRNA GAS5 in aconite decoction group was significantly lower（P < 0.01）.The fluorescence expression of TNF-α，MMP-3 and ADAMTS-5 was significantly decreased.Conclusion：Wutou Tang can inhibit the inflammatoryreaction of chondrocytes in osteoarthritis and maintain the stability of extracellular matrix of cartilage，which is related to the regulation of the relative level of expression of lncRNA GAS5.

【Keywords】 osteoarthritis;Wutou Tang（烏頭湯）;inflammatory reaction;extracellular matrix of

cartilage;rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，多由人體肝腎虧虛，筋骨肌肉失養(yǎng)，外復(fù)感風(fēng)寒濕邪，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)痹阻、氣血運(yùn)行不暢，關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)，局部不通則痛，最終引起關(guān)節(jié)功能障礙［1-2］，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。目前針對(duì)OA的階梯治療分為基礎(chǔ)治療、藥物治療、修復(fù)性治療以及重建治療。其中藥物治療占有很大的比重，包括非甾體抗炎藥、關(guān)節(jié)腔注射藥物、抗焦慮藥物以及中藥等［3］。但是非甾體抗炎藥治療常常伴隨著肝腎功能損傷、血液系統(tǒng)損傷、脂質(zhì)代謝和（或）水鹽代謝紊亂、消化道刺激等不良反應(yīng)，而手術(shù)治療也存在高風(fēng)險(xiǎn)、高價(jià)格的缺點(diǎn)，且有1/3的患者出現(xiàn)術(shù)后疼痛或者功能沒(méi)有明顯的改善［4］。烏頭湯是治療骨痹的經(jīng)典方劑，在治療OA中被國(guó)內(nèi)專(zhuān)家共識(shí)高度推薦［5］。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（GAS5）在OA患者中表達(dá)升高，lncRNA GAS5可以通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥、自噬以及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解加劇OA進(jìn)程［6-7］。因此，本研究從炎癥和軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的角度出發(fā)，探討烏頭湯是否可以通過(guò)調(diào)控lncRNA GAS5的表達(dá)，降低下游腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）的水平，抑制白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退變。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量為（90±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25 ℃，濕度55%～60%，循環(huán)光照條件自動(dòng)控制在12 h光/暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境和飲食條件均符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（閩）2019-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院提供，包括制川烏6 g，麻黃、黃芪、炙甘草和芍藥各9 g。烏頭湯水提物的制備：制川烏先煎1 h后，依次將其余4味中藥共同加入再次煎煮1 h；除去烏頭湯中殘?jiān)?，過(guò)濾出烏頭湯藥液，制備烏頭湯水提物，配成 10 mg·mL-1烏頭湯水提物母液，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 IL-1β試劑（批號(hào)MKCL5731，美國(guó)Sigma公司）；Collagen Ⅱ抗體（貨號(hào)ab188570，批號(hào)GR3233600-8，美國(guó)Abcam公司）；TNF-α抗體（貨號(hào)17590-1-AP，批號(hào)00077108，美國(guó)Proteintech公司）；MMP-3（貨號(hào)bs-0413R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）和ADAMTS-5抗體（貨號(hào)bs-3573R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；RNA提取試劑（貨號(hào)R401-01，批號(hào)7E490L0，南京諾唯贊公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)R211-02，批號(hào)7E460H0，南京諾唯贊公司）；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TEK公司）；CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 大鼠經(jīng)5%異氟醚在2 L·min^-1氧氣中吸入麻醉，并維持在2%異氟醚中。將大鼠雙膝及周?chē)课灰泽w積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒，然后用眼科小剪從大鼠踝關(guān)節(jié)處剪開(kāi)皮膚，往大腿方向延伸，暴露出下肢肌肉。剔除肌肉后用咬骨鉗分離出雙膝關(guān)節(jié)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水洗去關(guān)節(jié)部位的肌肉、毛發(fā)。將膝蓋浸泡在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇下帶入提前紫外線消毒過(guò)后的超凈臺(tái)內(nèi)操作。剃取透明軟骨置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將其切碎至1 mm3大小。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化，待消化完全后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，以1000 r·min^-1離心5 min，離心半徑12.29 cm；去除上層上清液，往下層沉淀組織中加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM終止消化，并將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。鏡下觀察到軟骨細(xì)胞占滿(mǎn)培養(yǎng)瓶的80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察到第2代軟骨細(xì)胞形態(tài)較好，胞漿豐富，因此，選擇第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，分為陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組加入Collagen Ⅱ抗體（1∶200）；陰性對(duì)照組加PBS作為對(duì)照，在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，隔天PBS沖洗后加入二抗，在室溫條件下反應(yīng)30 min，經(jīng)PBS清洗后使用DAB室溫浸潤(rùn)顯色，復(fù)染時(shí)使用蘇木素浸潤(rùn)30 s，然后用PBS溶液返藍(lán)，最后經(jīng)脫水和中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、攝片和分析。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本研究將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和烏頭湯組。根據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ)，第2代軟骨細(xì)胞在2 mL培養(yǎng)基中以1×10⁵·mL^-1密度接種到6孔板中，模型對(duì)照組采用10 ng·mL^-1IL-1β干預(yù)24 h誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變，24 h后更換2 mL新鮮培養(yǎng)基（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FPS的EDEM）繼續(xù)培養(yǎng)［8］。課題組前期通過(guò)MTT法測(cè)定烏頭湯對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)150 μg·mL^-1烏頭湯水提物干預(yù)24 h具有較好的效果［9］。在6孔板烏頭湯組中采用10 ng·mL^-1IL-1β干預(yù)24 h后，更換為150 μg·mL^-1烏頭湯水提物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5的相對(duì)表達(dá)水平 根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取軟骨細(xì)胞總RNA，將傳代后的第2代軟骨細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到6孔板中，密度為1×10⁵·mL^-1，每個(gè)孔添加Trizol消化軟骨細(xì)胞。隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟建立逆轉(zhuǎn)錄體系，設(shè)置條件為37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，最后4 ℃ forever進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)Real-time PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行確認(rèn)，使用2－△△CT方法比較目的基因與內(nèi)參基因平均CT值差異，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。Real-time PCR相關(guān)引物見(jiàn)表1。

2.4 免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的熒光表達(dá)量 各組軟骨細(xì)胞在室溫下用體積分?jǐn)?shù)為10%的正常山羊血清孵育1 h，PBS清洗后加入抗體（TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5）于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。隔天PBS洗滌干凈后，將其分別孵育在帶有異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記或CY3熒光染料的山羊抗兔多克隆抗體中，室溫避光1 h，以DAPI染色法對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，放置于鏡下觀察并拍照記錄。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)行多重比較，方差齊時(shí)采用LSD分析法，方差不齊時(shí)采用Games Howell法，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果 第2代軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，軟骨細(xì)胞胞核呈現(xiàn)藍(lán)色且清晰可見(jiàn)。陽(yáng)性對(duì)照組胞漿區(qū)呈現(xiàn)棕黃色，見(jiàn)圖1（1）；陰性對(duì)照組胞漿區(qū)不著色，見(jiàn)圖1（2）。

3.2 各組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)水平比較 Real-time PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組lncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，烏頭湯組lncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3.3 各組軟骨細(xì)胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的熒光表達(dá)量比較 在不同染色后可以觀察到TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5免疫熒光染色呈現(xiàn)出清晰的綠色和紅色。軟骨細(xì)胞核在DAPI染色下均表現(xiàn)為藍(lán)色；與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5熒光表達(dá)更強(qiáng)，經(jīng)過(guò)烏頭湯干預(yù)后熒光表達(dá)降低。見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

4 討 論

根據(jù)OA發(fā)病特征和臨床特點(diǎn)，屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載多種疾病的痹證，而OA屬于肢體關(guān)節(jié)的“骨痹”范疇?！端貑?wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論篇》曰：“痛在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！闭f(shuō)明骨痹是由于骨髓空虛，寒邪乘虛而入，導(dǎo)致肢體疼痛沉重，抬舉無(wú)力?！夺t(yī)宗必讀》認(rèn)為，骨痹就是寒痹和痛痹的結(jié)合，可見(jiàn)四肢攣急，關(guān)節(jié)疼痛、腫脹。中醫(yī)治療骨痹，依據(jù)辨證論治可以針對(duì)性地運(yùn)用活血止痛、補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)散寒、利水消腫等多種方法。烏頭湯出自《金匱要略》，是臨床治療OA的經(jīng)方之一，全方由制川烏、麻黃、黃芪、芍藥和炙甘草5味中藥組成。方中制川烏為君藥，性辛熱，主散寒除濕，止關(guān)節(jié)痹痛。李具寶等［10］統(tǒng)計(jì)491篇中藥治療OA的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)制川烏是用藥頻率最高的藥物，為28%。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，烏頭湯治療OA療效良好，具有溫陽(yáng)散寒通絡(luò)、除濕止痛的功效［11］。生物信息學(xué)和分子對(duì)接研究證實(shí)，烏頭湯可以抑制MMPs的水平防止ECM降解，維持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整性［12］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏頭湯能抑制OA患者血清中IL-1β、TNF-α、MMPs水平，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制ECM降解［13］。

lncRNA GAS5在生長(zhǎng)停滯期間普遍高表達(dá)，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)OA發(fā)展［14］。針對(duì)lncRNA GAS5的敲除可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞G1期阻滯［6］。在OA軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5表達(dá)上調(diào)，miR-21表達(dá)下調(diào)，lncRNA GAS5作為miR-21的負(fù)調(diào)節(jié)因子，刺激軟骨ECM降解［7］。在OA患者中，MMPs和ADAMTS的異常升高導(dǎo)致軟骨ECM穩(wěn)態(tài)失衡，降解超過(guò)合成，加劇了軟骨退變。TNF-α等炎癥因子同樣會(huì)促進(jìn)MMPs和ADAMTS的表達(dá)，進(jìn)而參與這種動(dòng)態(tài)平衡［15］。本研究從炎癥和軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的角度出發(fā)，通過(guò)檢測(cè)TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的表達(dá)，探討烏頭湯是否可以通過(guò)調(diào)控lncRNA GAS5的表達(dá)，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退變。Real-time PCR結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5水平升高，并且這個(gè)趨勢(shì)在烏頭湯干預(yù)后得到抑制，說(shuō)明烏頭湯可以通過(guò)抑制lncRNA GAS5的表達(dá)延緩軟骨細(xì)胞退變。

本研究免疫熒光結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞中TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5熒光表達(dá)量增加，而在烏頭湯干預(yù)后熒光表達(dá)量減弱。TNF-α是與OA發(fā)展密切相關(guān)的炎癥介質(zhì)，OA患者通常伴有軟骨細(xì)胞中TNF-α過(guò)度表達(dá)，與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［16］。抑制TNF-α水平可以促進(jìn)軟骨修復(fù)，改善關(guān)節(jié)炎癥狀［17］；同時(shí)，TNF-α也可誘導(dǎo)MMPs和ADAMTS的表達(dá)促進(jìn)ECM降解［18］。ECM主要由Ⅱ型膠原和蛋白多糖組成，MMP-3是OA的重要調(diào)節(jié)因子，它作為一種具有強(qiáng)大破壞性的蛋白酶，可以降低膠原蛋白和蛋白多糖的表達(dá)，在ECM的生理轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用，并激活其他膠原酶［19-20］。ADAMTS-5屬于ADAMTS家族，通過(guò)切割聚集蛋白聚糖導(dǎo)致ECM中蛋白多糖的降解［21］，蛋白多糖被水解后吸引水分子的能力下降，關(guān)節(jié)軟骨抗壓能力減弱，進(jìn)一步誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退化［22］。因此，在IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞中，TNF-α作為重要的促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)MMP-3和ADAMTS-5表達(dá)，通過(guò)降解蛋白多糖以及切割膠原蛋白導(dǎo)致ECM降解；而經(jīng)過(guò)烏頭湯干預(yù)后可以通過(guò)抑制TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5的表達(dá)延緩軟骨細(xì)胞退變。

綜上，本研究結(jié)果表明，烏頭湯可以抑制lncRNA GAS5表達(dá)，降低下游TNF-α、MMP-3和ADAMTS-5水平，抑制軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，防止ECM降解，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。本研究探討了烏頭湯治療OA退變軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，但是未涉及烏頭湯與OA相關(guān)證型之間的關(guān)系，后續(xù)會(huì)增加體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)比觀察烏頭湯對(duì)不同證型OA大鼠的治療效果。

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收稿日期：2022-11-12；修回日期：2022-12-23