梔子及其有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

葛 穩(wěn)，高蔥蔥，李東陽(yáng)，陳衛(wèi)東，周婷婷 （.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽 合肥 2002；2.中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系 上海 2004；.島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司, 上海 2002）

梔子是茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實(shí)[1]，主要產(chǎn)地為江西省撫州市、河南省唐河縣等，中醫(yī)藥應(yīng)用歷史悠久，是一種藥食兩用資源。其具有清熱祛火、緩解心煩、消腫止痛、化痰止咳等功效，用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍，外治扭挫傷痛[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)梔子做了大量的研究，證明了梔子中含有環(huán)烯醚萜、單萜、二萜、三萜、黃酮類、有機(jī)酸和揮發(fā)性化合物等豐富的化學(xué)成分[2-4]，具有抑制神經(jīng)系統(tǒng)[5]、保肝[6-7]、抗氧化[8]、降血糖[9-11]、利膽[12]、鎮(zhèn)痛[13-14]等藥理作用，其中主要的有效成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物。

目前對(duì)于環(huán)烯醚萜苷類化合物的富集純化主要以大孔吸附樹脂為主[15-18]，本課題組前期建立了一種用梔子果實(shí)制備總環(huán)烯醚萜苷的方法，并獲得了國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（ZL200510026144.5）。此制備工藝得率高，成本低廉，為環(huán)烯醚萜苷類成分的研究及探索梔子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供技術(shù)支持，對(duì)梔子及其有效部位的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)至關(guān)重要。

梔子環(huán)烯醚萜苷類有效部位的質(zhì)量控制指標(biāo)與梔子藥材相比，其重點(diǎn)在于薄層色譜鑒別、檢查及含量測(cè)定，其中檢查項(xiàng)包括水分、重金屬及有害元素。中藥在貯藏及保管的過程中，水分含量是影響藥材質(zhì)量及其性狀的重要因素。水分較高可導(dǎo)致藥材霉變或蟲蛀，為微生物和害蟲提供良好的生長(zhǎng)繁殖條件，從而進(jìn)一步影響其有效部位的質(zhì)量。重金屬污染是中藥在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程中可能會(huì)出現(xiàn)的污染類型，而中藥成分中的重金屬污染主要包括銅、汞、砷、鎘、鉛等?，F(xiàn)代科學(xué)表明，殘留的重金屬能夠與人體中的酶蛋白牢固結(jié)合，對(duì)組織細(xì)胞的功能、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的破壞。而用梔子果實(shí)制備總環(huán)烯醚萜苷時(shí)，有機(jī)化合物根據(jù)分子量大小可以經(jīng)溶劑洗脫分開而達(dá)到除雜的目的，從而減少梔子有效部位中的重金屬元素殘留量。本研究采用大孔吸附樹脂法制備梔子有效部位，選用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對(duì)梔子及其有效部位中殘留的重金屬元素進(jìn)行測(cè)定，旨在為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

目前，總環(huán)烯醚萜苷的質(zhì)量控制方法中僅以紫外分光光度法測(cè)定其含量[19]，缺少針對(duì)總環(huán)烯醚萜苷整體的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，故本研究在梔子藥材的質(zhì)量控制基礎(chǔ)上建立了梔子有效部位的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

中藥粉碎機(jī)（YF103-200g）；KQ-800DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SX2-4-10A箱式電阻爐（上海索域試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ETHOS UP微波消解儀（意大利Milestone公司）；Milli-Q Advantage超純水儀（美國(guó)Merck Millipore公司）；AP135W電子天平、ICPMS-2030電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、LC-10AT高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]。

1.2 試藥

梔子藥材購(gòu)自安徽省亳州市；梔子有效部位（自制[15]；梔子對(duì)照藥材（批號(hào)：120986-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；梔子對(duì)照品（批號(hào)：AF20062303，純度98%，成都埃法生物科技有限公司）；乙醇、乙酸乙酯、甲酸、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）；丙酮、硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；濃硝酸（美國(guó)Fisher chemical公司）；鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，批號(hào)：218025103，美國(guó)AccuStandard公司）；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，批號(hào)：221008-5）、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1 000 μg/ml，批號(hào)：208030-6）、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，批號(hào)：215022-7）、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，批號(hào)：206020-5）均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

稱取梔子粉末、梔子有效部位粉末和梔子對(duì)照藥材粉末適量，參照《中國(guó)藥典》（2020年版）一部梔子鑒別項(xiàng)下薄層色譜法，制備得到濃度分別為0.100 4、0.100 6、0.101 2 g/ml的梔子和梔子有效部位供試品溶液以及梔子對(duì)照藥材溶液。再取梔子苷對(duì)照品，以乙醇為溶劑制成4 mg/ml的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各3 μl分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-丙酮-水(5∶1∶5∶1)為展開劑展開，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，于110 ℃加熱使其顯色，直至斑點(diǎn)顯色清晰。梔子及其有效部位供試品色譜中，在與梔子對(duì)照品和梔子對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同的特征斑點(diǎn)（見圖1）。

圖1 梔子薄層色譜圖

2.2 水分測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》（2020年版）四部通則0832水分測(cè)定法第二法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定梔子含水量為8.4%，符合《中國(guó)藥典》（2020年版）一部梔子項(xiàng)下對(duì)水分的規(guī)定。梔子有效部位的含水量為3.2%。

2.3 總灰分測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》（2020年版）四部通則2302總灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定總灰分為5.4%，符合《中國(guó)藥典》（2020年版）一部梔子項(xiàng)下對(duì)總灰分的規(guī)定。

2.4 重金屬及有害元素測(cè)定

2.4.1 ICP-MS測(cè)定工作條件

ICP-MS儀器主要參數(shù)設(shè)定見表1。

表1 ICP-MS儀器主要參數(shù)

2.4.2 供試品溶液的制備

取梔子藥材粗粉和梔子有效部位粉末各0.5 g，于60 ℃干燥2 h，加入硝酸8 ml，置于耐壓耐高溫微波消解罐中。0～10 min內(nèi)溫度從室溫升至120 ℃，10～20 min從120 ℃升至180 ℃，于180 ℃保持20 min，最后從180 ℃降至60 ℃，按照此消解條件進(jìn)行消解。消解完全后，待消解液冷卻至60 ℃以下時(shí)，移出消解罐，將消解液轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，用適量水將消解罐洗滌3次，洗滌液合并于量瓶中，加入金標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μl，以水為溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以10%硝酸為溶劑配制成各元素相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合系列溶液。其中，鉛：0、1、5、10、20 ng/ml；鎘：0、0.5、2.5、5、10 ng/ml；砷：0、1、5、10、20 ng/ml；銅：0、50、100、200、500 ng/ml；汞：0、0.2、0.5、1、2、5 ng/ml。以系列標(biāo)準(zhǔn)液濃度（X，ng/ml）為橫坐標(biāo)，元素響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各元素線性關(guān)系見表2。

表2 5種元素線性關(guān)系考察

2.4.4 精密度

取含砷 1 ng/ml、鎘 0.5 ng/ml、銅 50 g/ml、汞0.2 ng/ml、鉛1 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定的儀器工作條件下重復(fù)測(cè)定5次，各測(cè)定元素的RSD值分別為0.53%、0.82%、0.32%、0.57%、0.40%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性

取梔子藥材、梔子有效部位供試品粉末分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，平行制備5份，在相同的儀器工作條件下進(jìn)行分析，所測(cè)5種元素的RSD為0.30%～4.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性

各取上述梔子以及梔子有效部位的供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8 h后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算兩種供試品溶液中5種重金屬元素的含量，結(jié)果各元素含量的RSD在0.15%～2.64%之間（n=5），表明兩種供試品溶液中各測(cè)定元素在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.7 加樣回收率

精密稱取已知含量的梔子以及梔子有效部位供試品各3份，分別精密加入各測(cè)定元素相應(yīng)的對(duì)照品溶液適量，按“2.4.2”項(xiàng)下步驟操作，測(cè)定，計(jì)算各測(cè)定元素的回收率及RSD值，結(jié)果見表3。

表3 梔子及梔子有效部位中重金屬及有害元素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 樣品含量測(cè)定

按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下工作條件測(cè)定兩種樣品，每份樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見表4。

表4 梔子及梔子有效部位中5種重金屬元素的含量(mg/kg)

2.5 梔子苷含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%醋酸水（15：85）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.5.2 對(duì)照品溶液

精密稱取梔子苷對(duì)照品25.21 mg置于25 ml量瓶中，加甲醇制成含梔子苷1.008 mg/ml的溶液，精密量取0.3 ml至10 ml量瓶中，以甲醇為溶劑稀釋至刻度，制成含梔子苷30.24 μg/ml的溶液。

2.5.3 供試品溶液

分別精密稱取梔子樣品粉末（過四號(hào)篩）約0.1035g、梔子有效部位粉末13.36 mg，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 ml甲醇，稱定重量并記錄，超聲20 min后放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置于25 ml量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 專屬性

將空白對(duì)照溶液（甲醇）、梔子苷對(duì)照品溶液、梔子供試品溶液和梔子有效部位供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，得到色譜圖（圖2），梔子藥材中其余成分及空白溶液對(duì)梔子苷的測(cè)定無(wú)影響。

圖2 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

2.5.5 線性和范圍

將1.008 mg/ml的梔子苷對(duì)照品溶液用甲醇稀釋制成322.6、161.3、80.64、40.32、20.16 μg/ml的系列溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，以對(duì)照品濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=15860X+22 543，r=0.999 9，表明梔子苷在20.16～322.6 μg/ml的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.6 精密度

吸取濃度為80.64 μg/ml的對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD值為1.86%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性

取同一批梔子藥材以及梔子有效部位粉末各6份，分別按上述供試品制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。計(jì)算梔子藥材及有效部位中梔子苷的含量，RSD分別為2.38%、2.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性

取梔子藥材、梔子有效部位的供試品溶液，于制備后0、2、4、6、8 h分別按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果梔子苷峰面積的RSD分別為0.50%、0.81%。結(jié)果表明兩種供試品溶液在室溫下放置8 h穩(wěn)定。

2.5.9 加樣回收率

取梔子藥材粉末約0.1 g，共6份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入濃度為1 mg/ml的對(duì)照品溶液6 ml，精密加入甲醇19 ml，稱定重量并記錄，超聲處理20 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表5。

表5 梔子苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.10 含量測(cè)定

取梔子及梔子有效部位粉末按“2.5.3”項(xiàng)下方法分別配制供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算得梔子及其有效部位中梔子苷含量分別為5.71%、34.2%，結(jié)果見表6。

表6 梔子藥材及有效部位中梔子苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

梔子為傳統(tǒng)中藥，其有效部位是從梔子果實(shí)的乙醇提取物中制備得到的環(huán)烯醚萜苷類化合物，是后續(xù)制備中藥復(fù)方制劑的常用成分，建立并規(guī)范梔子有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以保證其質(zhì)量，為臨床療效提供保障。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)梔子有效部位進(jìn)行薄層色譜鑒別、水分檢查、重金屬及有害元素檢查、含量測(cè)定。水分、重金屬及有害元素的含量直接影響到梔子有效部位的質(zhì)量。環(huán)烯醚萜苷類成分易溶于水，水分含量過高時(shí)，在一定溫度、酸度條件下，可能會(huì)產(chǎn)生顏色變化或沉淀。本文建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定梔子有效部位中5種重金屬元素的分析方法，通過線性、檢出限、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率，對(duì)該方法進(jìn)行考察，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、選擇性好，可用于梔子有效部位中5種重金屬元素的同時(shí)檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得梔子藥材的含水量為8.4%，梔子有效部位的含水量為3.2%。梔子有效部位中鎘、銅、汞、鉛4種重金屬元素的含量較梔子藥材明顯下降，而梔子苷的含量則顯著提高。經(jīng)分析，梔子果實(shí)制備得到總環(huán)烯醚萜苷粉末時(shí)，在減壓濃縮干燥過程中水分蒸發(fā)導(dǎo)致梔子有效部位的含水量下降；梔子果實(shí)粗提物經(jīng)大孔吸附樹脂純化時(shí)，先以少量水洗脫去除雜質(zhì)，減少了環(huán)烯醚萜苷類成分的損失，再以低濃度乙醇洗脫有效成分，減少弱極性雜質(zhì)的洗脫量，進(jìn)而提高純度，使得4種重金屬元素含量降低，梔子苷含量提高。

本研究首次建立了梔子有效部位的質(zhì)量控制方法，此方法重現(xiàn)性好、操作性強(qiáng)，能夠有效控制梔子有效部位的質(zhì)量，為全面控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量和臨床療效提供依據(jù)。