不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜及4種生物堿含量測定

多杰措，李彩霞，許顯莉，宋文珠，馬世震*

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所；2青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

伏毛鐵棒錘(AconitumflavumHand.-Mazz.)屬于毛茛科烏頭屬植物，別名斷腸草、烏藥和一支蒿等[1]，是我國傳統(tǒng)民族藥材和民間中草藥，塊根和幼苗入藥，其干燥塊根俗稱“鐵棒錘”[2]?！蛾兾髦胁菟帯酚涊d伏毛鐵棒錘具有活血祛瘀、止痛、祛風(fēng)濕、消腫敗毒、止血、治跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛等功效。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生物堿類是伏毛鐵棒錘的主要活性成分[3]，烏頭堿是鐵棒錘藥材的主要化學(xué)成分且含量較高[4,5]。伏毛鐵棒錘和鐵棒錘含量差異的主要成分是12-表歐烏頭堿和烏頭堿，伏毛鐵棒錘中12-表歐烏頭堿和烏頭堿的含量高于鐵棒錘[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，烏頭堿、12-表歐烏頭堿、宋果靈和3-乙酰烏頭堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌等活性[6-9]。

目前對伏毛鐵棒錘質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究鮮有報(bào)道，中藥指紋圖譜廣泛用于中藥質(zhì)量評價(jià)，可以較全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量[10,11]。因此，本研究建立了15批不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘藥材的HPLC指紋圖譜，并測定12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿、3-乙酰烏頭堿等4種生物堿的含量；其次，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012A版)進(jìn)行相似度評價(jià)，SPSS軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析，以期為伏毛鐵棒錘藥材指標(biāo)成分的篩選和系統(tǒng)全面地控制伏毛鐵棒錘藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 試劑與材料

1.1 試劑

12-表歐烏頭堿(批號DST200815-067)、宋果靈(批號DST210519-073)、烏頭堿(批號DSTDW000602)、3-乙酰烏頭堿(批號DST200825-127)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；乙腈(色譜純，德國默克股份兩合公司)；甲醇(色譜純，德國默克股份兩合公司)；磷酸(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；三乙胺(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)材料主要來自青海、甘肅、四川，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所馬世震研究員鑒定為伏毛鐵棒錘(AconitumflavumHand.-Mazz.)，標(biāo)本已存在西北高原生物研究所標(biāo)本館，標(biāo)本編號0341653，詳細(xì)信息見表1。

表1 伏毛鐵棒錘藥材來源Table 1 Source of A.flavum

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE excel C18PFP(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫0～8 min，5%A；20～30 min，10%A；30～31 min，10%→11%A；31～50 min，11%A；50～55 min，11%→16%A；55～59 min，16%→18%A；59～65 min，18%A；65～66 min，18%→21%A；66～75 min，21%→25%A；75～80 min，25%→30%A；80～85 min，30%→32%A；85～95 min，32%→40%A；95～100 min，40%A；100～105 min，40%→43%A；105～110 min，43%A；110～111 min，43%→45%A；111～120 min，45%A。檢測波長215 nm，檢測時(shí)間為120 min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，體積流量1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿和3-乙酰烏頭堿對照品適量，加甲醇制成含12-表歐烏頭堿0.18 mg/mL、宋果靈0.2 mg/mL、烏頭堿0.225 mg/mL、3-乙酰烏頭堿0.2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精確稱取伏毛鐵棒錘根的干燥粉末1.00 g，粉末過60目篩，置于50 mL三口異型燒瓶中，在選定的微波時(shí)間、溫度、料液比以及甲醇體積分?jǐn)?shù)下提取，共三次，抽濾得提取液并定容至5 mL的容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。采用高效液相色譜法對提取液進(jìn)行測定。

2.4 伏毛鐵棒錘藥材HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取S14樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，并計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.05%～0.70%，各共有峰相對峰面積RSD為0.3%～2.9%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取S14樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下制備方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，并計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.08%～1.8%，相對峰面積RSD為0.8%～3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S14樣品粉末，按“2.3”項(xiàng)下制備方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，并計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.01%～0.7%，相對峰面積RSD為0.3%～3.1%，表明該供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定版

取15批伏毛鐵棒錘樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得到HPLC圖譜。以AIA格式將15批樣品圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012A版)，共標(biāo)定了18個(gè)共有峰，通過與對照品比對，指認(rèn)出其中四個(gè)生物堿成分，分別為12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿和3-乙酰烏頭堿?；旌蠈φ掌飞V圖見圖1A、樣品色譜圖見圖1B及疊加圖譜見圖1C，其中R是對照圖譜。

圖1 混合對照品(A)、供試品(B)色譜圖以及15批藥材疊加指紋圖譜(C)Fig.1 Chromatograms of Mixed reference substance (A) and sample (B) and superposition HPLC fingerprints of 15 batches of A.flavum samples (C)注：4：12-表歐烏頭堿；5：宋果靈；15：烏頭堿；18：3-乙酰烏頭堿。Note:4:12-Epinapelline;5:Songorine;15:Aconitine;18:3-Acetylaconitine.

2.4.5 相似度評價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012A版)進(jìn)行相似度評價(jià)，15批次伏毛鐵棒錘藥材圖譜與對照指紋圖譜相似度范圍在0.769～0.952，說明不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘藥材質(zhì)量存在一定差異(見表2)。

表2 15批次伏毛鐵棒錘樣品指紋圖譜相似度評價(jià)Table 2 Similarity evaluation of 15 batches of A.flavum samples

2.4.6 不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘樣品聚類分析

將15批不同產(chǎn)地的伏毛鐵棒錘的18個(gè)共有峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用瓦爾德法，以平方歐式距離為樣品間距離，Z標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行聚類分析，聚類分析結(jié)果見圖2。由圖可知，伏毛鐵棒錘藥材被分為4類，S1、S2樣品為Ⅰ類，即甘肅和四川產(chǎn)地聚為一類；S3～S5樣品為Ⅱ類；S6～S13為Ⅲ類；S14、S15為Ⅳ類。不同產(chǎn)地質(zhì)量具有一定差異。

圖2 聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis results

2.4.7 主成分分析(PCA)

采用SPSS25.0軟件對15批伏毛鐵棒錘藥材中18個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對18個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3，以特征值大于1.2為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到5個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為82.549%，可代表伏毛鐵棒錘指紋圖譜共有峰的大部分信息。

表3 特征值及累積方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

通過正交旋轉(zhuǎn)，得到18個(gè)指標(biāo)在5個(gè)主成分中的旋轉(zhuǎn)成分矩陣(見表4)。根據(jù)旋轉(zhuǎn)矩陣推測，影響伏毛鐵棒錘藥材質(zhì)量差異的成分不是單一成分，而是多成分協(xié)同作用的結(jié)果[12,13]。主成分1的信息主要來自峰2、9、10、11、12、15；主成分2的信息主要來自峰6、8、17、18；主成分3的信息主要來自峰1、7、8；主成分4的信息主要來自峰3、4、5、14、16；主成分5的信息主要來自峰4。結(jié)合實(shí)際檢測結(jié)果可同時(shí)采用對5個(gè)主成分貢獻(xiàn)最大峰面積也較大的2、3、4、5、6、15號共有峰作為后期伏毛鐵棒錘的質(zhì)量控制指標(biāo)。其中4號峰為12-表歐烏頭堿，5號峰為宋果靈，15號峰為烏頭堿，2、3、6號峰需要進(jìn)一步確認(rèn)。

表4 伏毛鐵棒錘成分矩陣Table 4 Component matrix of A.flavum

利用SIMCA14.1分析軟件繪制主成分得分圖見圖3。結(jié)果表明，伏毛鐵棒錘藥材被分為4類，S1、S2樣品為Ⅰ類，S3～S5為Ⅱ類，S6～S13為Ⅲ類，S14、S15為Ⅳ類。與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 15批伏毛鐵棒錘樣品PCA得分圖Fig.3 PCA score chart of 15 batches of A.flavum

2.5 伏毛鐵棒錘中4種生物堿成分的含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察

吸取2.2項(xiàng)下配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.22 μm微孔濾膜濾過，依次設(shè)定進(jìn)樣量為0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、20 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(見表5)。

表5 對照品線性關(guān)系Table 5 Reference linear relationship

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4種生物堿成分的峰面積并計(jì)算 RSD值。12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿、3-乙酰烏頭堿峰面積的RSD分別為1.8%、0.4%、1.9%、2.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取S14樣品粉末，每份1.00 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算4種生物堿成分的含量，并計(jì)算測定結(jié)果的RSD值。12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿、3-乙酰烏頭堿峰面積的RSD分別為2.0%、0.9%、3.0%、2.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S14樣品粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄4種生物堿成分的峰面積并計(jì)算RSD值。12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿、3-乙酰烏頭堿峰面積的RSD分別為1.3%、0.4%、1.3%、1.5%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Table 6 Sample recovery test (n=6)

2.5.6 樣品含量測定

分別取15批伏毛鐵棒錘藥材樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別測定15批樣品中4種生物堿(見表7)。結(jié)果表明，伏毛鐵棒錘藥材中12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿和3-乙酰烏頭堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.010 8～1.784 5、0.011 3～3.123 4、0.038 7～2.598 1、0.018 8～0.655 7 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.266 5、0.689 5、1.316 6、0.184 1 mg/g，其中烏頭堿含量最高。青海果洛瑪沁機(jī)場樣品中四種生物堿總量最高，為5.319 8 mg/g，青海玉樹巴塘樣品中最低，為0.193 1 mg/g。青海玉樹江西林場樣品中12-表歐烏頭堿含量最高，為1.784 5 mg/g；青海瑪沁機(jī)場樣品中宋果靈含量最高，為3.123 4 mg/g；四川阿壩樣品中烏頭堿含量最高，為2.598 1 mg/g；青海貴南樣品中3-乙酰烏頭堿含量最高，為0.655 7 mg/g。

表7 15批伏毛鐵棒錘藥材中4種生物堿成分的含量Table 7 Contents of four alkaloids in 15 batches of A.flavum

3 討論

3.1 色譜條件的確定

12-表歐烏頭堿、宋果靈的最大吸收波長為210 nm，烏頭堿、3-乙酰烏頭堿的最大吸收波長為235 nm，考察了210、215、220、230 nm，為兼顧四個(gè)峰使響應(yīng)值達(dá)到最高，最終選擇215 nm為檢測波長?？疾炝薃gilent Eclipse Plus C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)、Unitary C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAK ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ACE excel C18PFP(250 mm×4.6 mm，5 μm)，通過對比對稱因子、分離度及峰形，最終選擇ACE excel C18PFP色譜柱?？疾炝怂嗉尤?.0、2.5、3.0 mL的三乙胺，加入2.5 mL的三乙胺色譜峰峰形及梯度洗脫效果較好，因此水相加入2.5 mL三乙胺。根據(jù)藥典和文獻(xiàn)[5,14,15]考察了乙腈：0.1%醋酸銨、乙腈：0.2%冰乙酸(加三乙胺調(diào)PH=6.2)、乙腈和水、乙腈：0.1%磷酸等流動相，最終選擇乙腈：0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，基線平滑，色譜峰分布均勻，分離效果好。

3.2 指紋圖譜及含量測定分析

在指紋圖譜中不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘樣品色譜峰的個(gè)數(shù)、保留時(shí)間及相同保留時(shí)間下峰面積都存在差異；15批藥材指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果在0.769～0.952；聚類分析將S1、S2樣品為Ⅰ類；S3～S5樣品為Ⅱ類；S6～S13為Ⅲ類；S14、S15為Ⅳ類。與主成分分析結(jié)果一致。主成分分析篩選出共有的特征成分，找出決定因素，為伏毛鐵棒錘藥材質(zhì)量評價(jià)提供參考。主成分分析以特征值大于1.2為提取標(biāo)準(zhǔn)，累積方差貢獻(xiàn)率大于80%時(shí)，得到5個(gè)主成分，可代表伏毛鐵棒錘指紋圖譜共有峰的大部分信息。根據(jù)含量測定結(jié)果可知12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿的含量較高且前期查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)均有抗炎鎮(zhèn)痛[6-9]等活性，而3-乙酰烏頭堿含量在各個(gè)樣品普遍較低不作為伏毛鐵棒錘質(zhì)量控制指標(biāo)。因此，根據(jù)含量測定和主成分分析結(jié)果本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用對5個(gè)主成分貢獻(xiàn)較大、峰面積也較大的2、3、4(12-表歐烏頭堿)、5(宋果靈)、6和15(烏頭堿)等6個(gè)特征性成分，其中2、3、6號峰未知，可以通過質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)，研究是否作為后期伏毛鐵棒錘質(zhì)量控制指標(biāo)。

含量測定結(jié)果表明青海產(chǎn)區(qū)的玉樹(S3)、久治(S4)、瑪沁(S5)的生物堿含量較高；Wang等[5]測定了青海果洛、玉樹、海東和寧夏固原伏毛鐵棒錘生物堿含量，結(jié)果表明果洛班瑪和玉樹的伏毛鐵棒錘中生物堿含量最高，這與本研究結(jié)果一致。4種成分中烏頭堿的總量最高，3-乙酰烏頭堿的總量最低，與Zhao[16]的研究結(jié)果一致。12-表歐烏頭堿、宋果靈、烏頭堿和3-乙酰烏頭堿的含量最高的產(chǎn)地分別是青海玉樹江西林場、青?，斍邫C(jī)場、四川阿壩、青海貴南；其中江西林場和瑪沁機(jī)場樣品中四種生物堿總量也為最高。不同地區(qū)伏毛鐵棒錘藥材質(zhì)量存在差異，這種差異可能由于藥材的生長環(huán)境、氣候、土壤、采集時(shí)間及生長年限等因素[17]對藥材次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致藥材相似度以及含量的差異性[18,19]。

《中國藥典》未涉及伏毛鐵棒錘藥材的HPLC質(zhì)量控制相關(guān)內(nèi)容，因此，本研究采用HPLC-DAD法建立了伏毛鐵棒錘藥材指紋圖譜，并對4種生物堿成分進(jìn)行含量測定，同時(shí)應(yīng)用相似度評價(jià)、聚類分析及主成分分析對不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)，三者相互驗(yàn)證補(bǔ)充，避免了以單一成分含量來評價(jià)藥材質(zhì)量好壞的弊端[13]，可以為伏毛鐵棒錘藥材的質(zhì)量評價(jià)提供參考。