基于Akt/mTOR/NF-κB信號通路研究地龍?zhí)崛∥飳Σ±硇孕募》屎翊笫蟮谋Ｗo作用

張侍玉，梁天鳴，方 柳，姚 倩，朱家峰，李 倩，張?zhí)m娥*

1濰坊醫(yī)學院護理學院；2濰坊醫(yī)學院生命科學與技術學院；3濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濰坊 261053

病理性心肌肥厚是心臟應對負荷超載等病理性刺激時做出的一種適應性反應[1]。當心臟壓力超負荷時，心肌細胞無法增殖以支持負荷增加的需求，左心室代償性肥厚以維持心輸出量，而持續(xù)的心肌肥厚最終導致心力衰竭甚至猝死[2]。藥用蚯蚓(lumbricus或earthworm)，即地龍，鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓的干燥體，含多肽、氨基酸、核苷酸和蛋白質(zhì)類化合物等活性成分[3]，有抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)細胞凋亡等多種藥理活性[4,5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，地龍可通過降低Ang Ⅱ，抑制血管緊張素轉化酶活性降低血壓[6]。然而，地龍對壓力負荷誘導的病理性心肌肥厚的作用及機制仍未明確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Vevo 3100 LT超高分辨率超聲系統(tǒng)(Visual sonics，加拿大)；qRT-PCR引物鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)均由上海生工生物合成；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，日本)；Cycler 480 System PCR儀(Roche，瑞士)；UV-2501紫外分光光度計(島津，日本)；p-NF-κB p65(8242S)、NF-κB p65(3033S)、IκB(9242S)、p-Akt(4060S)、Akt(4691S)、p-mTOR(9411S)和mTOR(2972S)均購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH(TA-08，中杉金橋，中國)；化學發(fā)光Fluor Chem FC3系統(tǒng)(Protein Simple，加拿大)。

1.2 方法

1.2.1 地龍?zhí)崛∥锏闹苽?/p>

干燥地龍勻漿后，60 ℃水浴浸泡1 h，4 ℃離心取上清液。脫鹽和純化使用KTA蛋白分析儀和Sephadex G-50 Desalting TM(3.2 cm×50 cm)柱進行凝膠過濾，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH：7.0)平衡。1 g地龍?zhí)崛∥锵喈斢?0 g地龍生藥材。具體制備方法見既往報道[3]。

1.2.2 動物分組、模型建立與給藥方法

30只雄性Wistar大鼠購自濟南鵬悅實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。隨機分為假手術組(S組)、模型組(M組)、模型+地龍低劑量組(M + L組)、模型+高劑量組(M + H組)和模型+卡托普利組(M + C組)，每組6只。采用AAC的方法建立病理性心肌肥厚模型。20%烏拉坦麻醉下切開腹腔，在腎動脈分支上1 cm處結扎將5號注射器針頭與腹主動脈共同結扎，造成腹主動脈環(huán)形縮窄，假手術不結扎。AAC手術后給予1周青霉素防治手術切口感染，地龍低劑量組和地龍高劑量組分別給予地龍400 mg/kg和800 mg/kg[11]腹腔注射，同時使用卡托普利(50 mg/kg)作為陽性對照藥[3,12]，假手術組和模型組則給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)21 d。

1.2.3 細胞分組及給藥

在SD大鼠出生48 h內(nèi)取出心臟，使用0.1%胰蛋白酶和0.03%膠原酶酶解得到新生大鼠原代心肌細胞[13]。除對照組給予完全培養(yǎng)基外，經(jīng)50 μmol/L的苯腎上腺素(phenylephrine，PE)[13]處理24 h的原代心肌細胞，被分為PE組、地龍低劑量組(4 mg/mL)、地龍高劑量組(8 mg/mL)和卡托普利組(10 μmol/L)。

1.2.4 小動物超聲心動圖檢查

首先，應用型民辦本科高校應聘請一些具有豐富教學經(jīng)驗的老教師，讓這些老教師對青年教師傳授經(jīng)驗，使其盡快成長。其次，應用型民辦本科高校應加強與相關企業(yè)的合作，培養(yǎng)學生的實踐能力。最后，應用型民辦本科高校應舉辦相關的專業(yè)報告會，可邀請企業(yè)優(yōu)秀人員到本校進行演講，這對開拓教師視野來說很有幫助。

大鼠在1.5%異氟烷吸入麻醉下進行心臟超聲檢測。大鼠心率維持在350～450次/min，使用Visual sonics Vevo 3100 LT超高分辨率超聲系統(tǒng)進行B超、M型超聲檢測，檢測大鼠心臟射血分數(shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(short axis shortening rate，F(xiàn)S)[14]。

1.2.5 心臟質(zhì)量指數(shù)檢測

大鼠稱量體重(body weight，BW)，使用二氧化碳安樂死后快速取出心臟。分別測量心臟重量(heart weight，HW)和左心室重量(left ventricular weight，LVW)，計算HW/BW及LVW/BW[15]。

1.2.6 心臟組織學染色

4%多聚甲醛固定后的心肌組織流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟滲透，溫度保持在62 ℃。將包埋的組織塊切為厚度4 μm的切片，脫蠟后進行HE染色，觀察拍照。

1.2.7 qRT-PCR

Trizol提取心臟組織總RNA，使用逆轉錄試劑盒(TOYOBO，日本)逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，日本)和基因引物進行實時定量PCR(見表1)。mRNA表達的相對定量采用2-ΔΔCt法計算結果，使用GAPDH表達將數(shù)據(jù)標準化。

表1 qRT-PCR擴增引物序列Table 1 Primers amplified by qRT-PCR

1.2.8 ELISA檢測

按ELISA試劑盒(西唐生物技術，中國)說明書，測定大鼠血清TNF-α蛋白水平。

1.2.9 Western blot

RIPA裂解液提取心臟組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入5 × Loading Buffer后在95 ℃下5 min使蛋白變性。使用10% SDS-PAGE分離膠電泳，隨后恒流電轉將蛋白轉至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉后，分別敷一抗(p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκB、GAPDH)4 ℃下過夜，二抗室溫孵育2 h后顯色。

1.2.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 地龍?zhí)崛∥飳AC誘導的大鼠心臟的影響

為了觀察地龍?zhí)崛∥飳AC誘導的大鼠心臟的影響，本研究對各組大鼠進行了小動物超聲檢測，還評估了心臟質(zhì)量指數(shù)(HW、HW/BW及LVW/BW)的變化。如圖1所示，與假手術組相比，模型組大鼠EF、FS降低(P<0.01)，表明模型組大鼠心臟收縮功能顯著下降；同時，HW、HW/BW及LVW/BW顯著高于假手術組(P<0.01)，提示AAC誘導的大鼠心臟出現(xiàn)心功能障礙，說明病理性心肌肥厚模型構建成功。有趣的是，與模型組比較，地龍?zhí)崛∥镏委熀蟮腁AC大鼠的EF、FS顯著升高(P<0.05)，而HW、HW/BW及LVW/BW顯著下降(P<0.05)，并且效果與卡托普利相當。這些數(shù)據(jù)表明地龍?zhí)崛∥飳AC誘導的大鼠心臟功能障礙有顯著改善作用。

圖1 地龍?zhí)幚韺Σ±硇孕募》屎翊笫笮呐K超聲指標及心臟質(zhì)量指數(shù)的影響Fig.1 Effects of earthworm treatment on echocardiographic indicators and heart mass index in rats with pathological cardiac hypertrophy 注：S：假手術組；M：模型組；M+L：模型+地龍低劑量組；M+H：模型+地龍高劑量組；M+C：模型+卡托普利組。與假手術組比較，#P<0.05，## P<0.01，### P<0.001；與模型組比較，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，下同。Note:S:Sham group;M:Model group;M+L:Model+earthworm low-dose group;M+H:Model+earthworm high-dose group;M+C:Model+Captopril group.#P<0.05,## P<0.01,###P<0.001 vs sham group; * P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs model group,the same below.

2.2 地龍?zhí)崛∥飳AC誘導的大鼠心肌肥厚的影響

為了研究地龍?zhí)崛∥飳Ω鹘M大鼠心臟組織學變化的影響，本研究通過HE染色觀察各組大鼠心臟組織形態(tài)學，結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞橫截面積明顯增大(P<0.001)，單位面積心肌細胞數(shù)目減少。與模型組比較，地龍低劑量組與高劑量組心肌細胞橫截面積明顯減小(P<0.05)，單位面積心肌細胞數(shù)目增多，與卡托普利陽性對照組大鼠心肌細胞病理改變結果一致(見圖2)。為了探究地龍?zhí)崛∥飳Σ±硇孕募》屎窕驑酥疚锏挠绊?，本研究通過qRT-PCR檢測了肥大基因標志物ANP、BNP及β-MHC的mRNA表達水平。由圖3顯示，與假手術組相比，模型組大鼠心臟組織中的ANP、BNP及β-MHC mRNA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，地龍治療可顯著降低ANP、BNP和β-MHC mRNA表達水平(P<0.05)，地龍低劑量組的治療效果優(yōu)于卡托普利。以上說明地龍?zhí)崛∥锟梢砸种艫AC誘導的病理性心肌肥厚。

圖2 各組大鼠心臟組織HE染色Fig.2 The representative images of HE staining in each group

圖3 地龍?zhí)幚韺Σ±硇孕募》屎翊笫驛NP、BNP及β-MHC基因表達的影響Fig.3 Effects of earthworm treatment on expression of mRNA ANP,BNP,and β-MHC in rats with pathological cardiac hypertrophy s,n=4)

2.3 地龍?zhí)崛∥飳AC誘導的心肌炎癥的影響

為了證明地龍?zhí)崛∥镌贏AC誘導的心肌炎癥反應中發(fā)揮重要作用，我們研究了促炎因子在各組大鼠心臟中的表達。如圖4所示，與假手術組相比，模型組大鼠炎癥相關基因TNF-α、IL-6表達水平和血清TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，而地龍各劑量治療組TNF-α、IL-6的基因表達和血清TNF-α含量顯著下降(P<0.05)，值得注意的是，地龍?zhí)崛∥锍尸F(xiàn)與卡托普利相當?shù)闹委熜Ч@表明地龍?zhí)崛∥锏目剐募》屎褡饔门c其抑制心臟促炎因子表達密切相關。

圖4 地龍?zhí)幚韺Σ±硇孕募》屎翊笫骉NF-α、IL-6 mRNA和血清TNF-α蛋白表達的影響Fig.4 Effects of earthworm treatment on TNF-α,IL-6 mRNA and TNF-α protein expression in rats with pathological cardiac hypertrophy

2.4 地龍?zhí)崛∥飳kt/mTOR/NF-κB信號通路蛋白表達的影響

為了檢驗地龍?zhí)崛∥锸欠裢ㄟ^Akt/mTOR/NF-κB信號通路改善病理性心肌肥厚，本研究通過Western blot檢測了大鼠心臟和原代心肌細胞Akt/mTOR/NF-κB通路相關蛋白的表達變化。與假手術組相比，模型組大鼠心臟組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，地龍各劑量組和卡托普利組大鼠心臟組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖5)。此外，與假手術組相比，模型組大鼠心臟組織中 p-NF-κB p65蛋白表達水平上調(diào)(P<0.001)，IκB蛋白水平下降(P<0.001)。與模型組相比，地龍各劑量組和卡托普利組心臟組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.001)，IκB蛋白上升至對照水平(P<0.01)(見圖6)。另外，PE誘導的原代心肌細胞肥大模型中，地龍?zhí)崛∥飳kt/mTOR/NF-κB通路相關蛋白表達的影響與AAC誘導的大鼠實驗結果一致(見圖7和圖8)。以上結果表明，地龍?zhí)崛∥锟赡芡ㄟ^Akt/mTOR/NF-κB通路的抑制而改善大鼠病理性心肌肥厚。

圖5 地龍?zhí)幚韺Σ±硇孕募》屎翊笫笮呐K組織中Akt、mTOR蛋白表達的影響Fig.5 Effects of earthworm treatment on expression of Akt and mTOR proteins in heart tissues of rats with pathological cardiac hypertrophy

圖6 地龍?zhí)幚韺Σ±硇孕募》屎翊笫笮呐K組織中NF-κB、IκB蛋白表達的影響Fig.6 Effects of earthworm treatment on expression of NF-κB and IκB proteins in heart tissues of rats with pathological cardiac hypertrophy

圖7 地龍?zhí)幚韺υ募〖毎鸄kt、mTOR蛋白表達的影響Fig.7 Effects of earthworm treatment on expression of Akt and mTOR proteins in primary cardiomyocytes 注：Con：對照組；PE：PE模型組；PE+L：PE模型+地龍低劑量組；PE+H：PE模型+地龍高劑量組；PE+C：PE模型+卡托普利組。與對照組比較，#P<0.05,## P<0.01，### P<0.001；與PE組比較，*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，下同。Note:Con:Control group;PE:PE model group;PE+L:PE model+earthworm low-dose group;PE+H:PE model+earthworm high-dose group;PE+C:PE model+Captopril group.#P<0.05,## P<0.01,### P<0.001 vs control group; * P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001 vs PE model group,the same below.

圖8 地龍?zhí)幚韺υ募〖毎鸑F-κB、IκB蛋白表達的影響Fig.8 Effects of earthworm treatment on expression of NF-κB and IκB proteins in primary cardiomyocytes

3 討論與結論

地龍以其天然的抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)凋亡等特性，在治療高血壓、糖尿病等方面發(fā)揮了顯著作用[4,5]。病理性心肌肥厚是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的高危因素，是多種心血管疾病的共同病理過程[16]；持續(xù)的病理性心肌肥厚觸發(fā)嚴重的心肌重構，導致心衰、猝死等[17]。近年來，大量研究表明，中藥提取物在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中具有明顯的保護作用[18,19]。課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)地龍可能通過降低Ang Ⅱ，抑制血管緊張素轉化酶活性來降血壓[3,6]。本研究進一步探究了地龍?zhí)崛∥镌贏AC誘導的病理性心肌肥厚模型中的作用及其作用機制。因此，本研究采用經(jīng)典的AAC方法建立病理性心肌肥厚模型，并以卡托普利為陽性對照[3,12]。

病理性心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、胚胎基因表達上調(diào)及炎癥反應增強[10,20]。與既往研究報道一致[7]，本研究結果顯示AAC模型組大鼠心臟功能受損，EF和FS值降低，大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)HW、HW/BW、和LVW/BW明顯提高。進一步，組織病理學染色結果發(fā)現(xiàn)，AAC導致心肌細胞橫截面積增大，心肌肥厚相關基因ANP、BNP、β-MHC表達顯著升高。這說明AAC成功誘導了大鼠的病理性心肌肥厚。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，地龍?zhí)崛∥镏委熀蟠笫蟮男呐K收縮功能得到明顯改善，AAC誘發(fā)的心臟質(zhì)量指數(shù)增高和組織形態(tài)學改變被顯著抑制，心肌肥厚標志物也恢復至正常水平，且地龍低劑量的治療效果優(yōu)于卡托普利，表明地龍?zhí)崛∥锟梢砸种艫AC 誘導的病理性心肌肥厚。此外，炎癥也參與病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程，促炎因子IL-6、TNF-α在心肌炎癥反應中發(fā)揮重要作用[10]。在本研究中，AAC誘發(fā)了心肌炎癥反應，IL-6、TNF-αmRNA表達水平顯著增高，而地龍?zhí)崛∥镏委煄缀蹩梢詫⒀装Y因子的表達恢復至正常水平，且治療效果與卡托普利相當，提示地龍?zhí)崛∥锟梢砸种蒲装Y反應從而改善AAC誘導的心肌肥厚。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR/NF-κB信號通路在病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]，心肌細胞特異性Akt、mTOR過表達可能導致心肌肥厚[21]。NF-κB在病理性心肌肥厚中，受多種因素的刺激，可激活TNF-α、IL-6等各種炎癥因子[22,23]。本研究結果顯示，AAC大鼠心肌肥厚程度明顯增加，心肌炎癥反應明顯增加。然而，在Akt/mTOR信號通路中，地龍治療組p-Akt和p-mTOR蛋白的表達明顯低于模型組。在NF-κB信號通路中，p-NF-κB p65的表達量降低，但IκB的表達量顯著增加。因此，Akt/mTOR/NF-κB信號通路可能在地龍治療病理性心肌肥厚過程中被抑制。另外，地龍?zhí)崛∥镞€可以抑制PE誘導的肥大心肌細胞中Akt、mTOR和NF-κB p65的磷酸化蛋白表達的升高。由此可見，地龍?zhí)崛∥锟赡芡ㄟ^抑制Akt/mTOR/NF-κB信號通路在病理性心肌肥厚中發(fā)揮保護作用，但具體的級聯(lián)反應及靶點有待進一步研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)地龍對壓力負荷誘導的病理性心肌肥厚有一定的保護作用，其機制可能與抑制AAC誘導的心肌肥大和心肌炎癥有關，并通過Akt/mTOR/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。本研究為地龍的進一步臨床應用提供了實驗依據(jù)，也為病理性心肌肥厚和心衰的防治提供了新的思路。然而，地龍抑制病理性心肌肥厚有效成分的一級結構尚未闡明，有待進一步研究。本課題將進一步探究地龍防治心衰的有效成分及其作用機制。