八味通里顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙昱瑋 司學(xué)玲 任 輝 張瀚水 龔本義 南敏倫 赫玉芳 趙紅菲

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，吉林長春 130117；2.修正藥業(yè)集團長春高新制藥有限公司質(zhì)量管理部，吉林長春 130012；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院普外科，吉林長春 130033；4.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130021；5.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所，吉林長春 130012；6.長春中醫(yī)藥大學(xué)健康管理學(xué)院，吉林長春 130117

八味通里顆粒由大黃、芒硝、炒萊菔子、厚樸、枳殼、檳榔、地黃、枳實組成。取自漢代《傷寒論》“大承氣湯”加減而成。具有通腑泄熱、滋陰潤燥、行氣活血的功效。用于陽明腑實所致大便秘結(jié)不通、脘腹脹滿、疼痛拒按、高熱神昏、譫語、口干舌燥，舌紅苔黃膩，脈滑數(shù)屬?？捎糜谛g(shù)后腸梗阻、單純性腸梗阻、粘連性腸梗阻、急性膽囊炎、急性胰腺炎、急性闌尾炎等見上述侯證候者。方中大黃[1-2]苦寒瀉熱，祛瘀通便，蕩滌腸胃邪熱積滯，消除致病之因，用為君藥。芒硝[3-4]咸苦而寒，瀉熱通便，潤燥軟堅，協(xié)大黃則峻下熱結(jié)，用為臣藥。積滯內(nèi)阻，腑氣不通，內(nèi)結(jié)之積滯恐難速下，重用厚樸、枳殼、炒萊菔子、枳實、檳榔行氣寬中，消脹除滿，燥屎熱結(jié)傷陰故使以生地滋陰潤燥養(yǎng)血[5-14]。共成通腑泄熱、滋陰潤燥，行氣活血之功效。

為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，本研究對八味通里顆粒中的炒萊菔子、大黃、檳榔進行薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）鑒別，并通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定枳殼和枳實中新橙皮苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent）；KQ2200DE型超聲波清洗器（昆山舒美）；QUINTIX125D-1CN型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

芥子堿硫氰酸鹽、大黃素、大黃酚、新橙皮苷對照品（批號分別為111702-202006、110756-201913、110796-201922、111857-201804，純度分別為99.0%、96.0%、99.4%、99.4%，中檢院）。乙腈（色譜純，Sigma），薄層板為青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)，其他試劑均為分析純（AR）。八味通里顆粒（批號：20210901、20210902、20210903，吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）。

2 試驗方法

2.1 薄層鑒別

2.1.1 炒萊菔子 稱量研細(xì)后的八味通里顆粒3 g于具塞錐形瓶中，加25 ml無水乙醇，在50℃條件下超聲40 min，置冷水中冷卻后濾過，回收乙醇提取液，殘渣用乙酸乙酯浸泡2次，10 min/次、每次20 ml，分離并棄去乙酸乙酯液，殘渣揮干，加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。萊菔子對照藥材，磨成細(xì)粉，稱取0.5 g，加水20 ml，按照供試品制備方法制成對照藥材溶液。精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。照《中國藥典》2020年版四部通則0502 TLC試驗，吸取上述三種溶液各3～6 μ1，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（20∶4∶6）放置分層的上層溶液為展開劑，于上行展開缸中展開后，取出，晾干，放置在三用紫外分析儀上在365 nm下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 炒萊菔子薄層色譜圖

2.1.2 大黃 取八味通里顆粒3 g，研成細(xì)粉，加入25 ml甲醇，在50℃條件下超聲30 min，放置至室溫，濾過，濾液回收溶劑至干，加去離子水10 ml、濃鹽酸1 ml，100℃加熱回流水解30 min，冷卻后，用三氯甲烷提取水解液2次，每次10 ml，合并兩次三氯甲烷液，揮干溶劑，殘渣加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材細(xì)粉0.1 g，按照供試品的制備方法制成對照藥材溶液。再取大黃素、大黃酚適量，加三氯甲烷制成每1 ml分別含0.5 mg的溶液，為對照品溶液。照《中國藥典》2020年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各1～3 μ1，點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（30∶10∶2）放置的上層溶液為展開劑，于上行展開缸中展開后，取出，自然晾干，放置在三用紫外分析儀上在365 nm下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖2。

圖2 大黃薄層色譜圖

2.1.3 檳榔 取八味通里顆粒10 g，研成細(xì)粉，先加入2 ml濃氨試液，攪拌使粉末潤濕、再加入40 ml三氯甲烷，搖勻，放置30 min，超聲30 min，分取三氯甲烷液，用鹽酸（1→5）溶液30 ml，振搖提取，取鹽酸水層，用氨試液調(diào)節(jié)pH=9，再用三氯甲烷振搖提取2次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，揮干，殘渣加1 ml甲醇攪拌使溶解，為供試品溶液。另取檳榔對照藥材粉末l g，按照上述供試品制備方法制成對照藥材溶液。照《中國藥典》2020年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5～10 μl，點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-濃氨試液（15∶15∶0.2）為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，上行展開都，取出，自然晾干，置放置碘的密閉空間中顯色。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖3。

圖3 檳榔薄層色譜圖

2.2 新橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件 分析柱為ACE-C（184.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.25%磷酸溶液（19∶81）為流動相，檢測波長283 nm，流速0.9 ml/min，柱溫25℃，進樣量10 μl。見圖4。

圖4 HPLC色譜圖

2.2.2 八味通里顆粒供試品溶液的制備 取八味通里顆粒，用研缽研成細(xì)粉，取約1 g，精密稱重，置具塞錐形瓶中，加甲醇溶液25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）60 min，放置至室溫，稱重，加甲醇溶液補量，振蕩均勻，濾過（0.2 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取新橙皮苷對照品適量，加甲醇超聲溶解，制成含新橙皮苷質(zhì)量濃度約為105 μg/ml的溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶液各2、4、8、12、16、20 μl，分別利用液相色譜儀進行測定，橫坐標(biāo)（X）為新橙皮苷的進樣量（μg），縱坐標(biāo)（Y）為新橙皮苷的峰面積（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=1496.2X-31.92，r=0.9998，結(jié)果表明，新橙皮苷含量在0.21～2.10 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2.5 精密度試驗 取八味通里顆粒同一供試品溶液（20210902），照“2.2.1”色譜條件連續(xù)測定6次，新橙皮苷峰面積的RSD為0.65%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取八味通里顆粒（20210902），照“2.2.2”制備6份供重復(fù)性測定用的供試品溶液，照“2.2.1”色譜條件進行測定，新橙皮苷含量的平均值為1.61 mg/g，RSD為1.15%（n=6），說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取八味通里顆粒（20210902）同一供試品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h各進行測定，新橙皮苷峰面積RSD為1.48%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率考察 取八味通里顆粒（20210902）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.8220 mg/ml新橙皮苷對照品1 ml，制備供試品溶液，按色譜條件測定，實驗結(jié)果如表1。計算得到新橙皮苷的平均回收率為99.91%，RSD為0.43%。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.2.9 含量測定 取20210901、20210902、20210903批次八味通里顆粒樣品，按照“2.2.2”下方法制備供試品并進行檢測，3批顆粒新橙皮苷含量分別為1.58、1.61、1.60 mg/g，平均含量為1.60 mg/g。按照新橙皮苷不低于80%計，八味通里顆粒中新橙皮苷的含量應(yīng)不低于1.20 mg/g。

3 討論

3.1 薄層鑒別

對八味通里顆粒中各藥味進行了摸索，最終建立了炒萊菔子、大黃、檳榔的薄層鑒別方法。參考《中國藥典》2020年版一部及參考文獻[15-20]中的薄層鑒別方法，對八味通里顆粒中炒萊菔子、大黃、檳榔鑒別方法進行優(yōu)化，確定了最優(yōu)的薄層色譜條件。

3.2 含量測定

①分別考察了甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液流動相系統(tǒng)[21-24]，考察了ACE-C18、Agilent ODS-C18、Hypersil ODS-C18色譜柱，考察了不同的檢測波長、柱溫的影響，最終確定分析柱為ACE-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.25%磷酸溶液（19∶81）為流動相，檢測波長283 nm，流速0.9 ml/min，柱溫25℃，進樣量10μl的色譜條件。②以提取的新橙皮苷含量為評價指標(biāo)，對提取的溶劑（分別設(shè)定甲醇和乙醇）、提取溶劑用量（25、50 ml）、提取的方式（超聲提取、加熱回流提?。?、提取時間（30、60、90 min）進行考察，最終確定的提取方法為甲醇25 ml，超聲處里60 min。最終建立的HPLC測定八味通里顆粒中新橙皮苷含量專屬性強、重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

本研究建立了八味通里顆粒中炒萊菔子、大黃、檳榔的定性鑒別方法和新橙皮苷的HPLC含量測定方法，方法簡便操作性強，可用于八味通里顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。