煙草黑脛病生防功能菌篩選及其應(yīng)用效果

郝浩浩 李 翔 郭傳濱 吳俊林 唐培培 趙佳佳 孫會(huì)忠

（1河南省煙草公司駐馬店市公司，河南駐馬店 463000；2河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000）

絡(luò)石（T.jasminoides）屬夾竹桃科絡(luò)石屬，是一種傳統(tǒng)中草藥植物，有抑菌、抗痛風(fēng)之效，臨床多用于治療坐骨神經(jīng)、關(guān)節(jié)炎、喉痹咽塞、喘息不通、咳嗽喘息、腹瀉等癥[1]。除具有藥理作用外，絡(luò)石也是常見(jiàn)的園林觀賞植物。很多藥用植物因受到其生長(zhǎng)環(huán)境的地域差異和自身發(fā)育生物學(xué)等因素的影響，人們對(duì)其研究和開(kāi)發(fā)利用不夠深入[2]。從植物內(nèi)生細(xì)菌微生物資源中尋找功能菌已成為生物資源開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)方向。一些從藥用植物中分離出的特定內(nèi)生菌在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，往往能產(chǎn)生與其相同或相似的生物活性物質(zhì)，從而表現(xiàn)出特定的功能活性，這是植物內(nèi)生菌資源包括生防菌開(kāi)發(fā)研究的理論依據(jù)之一[3]。許多藥用植物的內(nèi)生菌不但能促進(jìn)植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育，內(nèi)生菌抑菌活性也可廣泛應(yīng)用于中藥植物栽培中的生物防治[4-5]。另外，一些藥用植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的活性成分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也有抑制作用，表現(xiàn)出抗腫瘤作用[6-8]。因此，從傳統(tǒng)中藥植物中分離篩選特色功能菌資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，全國(guó)各植煙區(qū)均有發(fā)生，對(duì)煙草生產(chǎn)造成了很大的損失。煙草綠色生產(chǎn)的客觀需求，使得生物防治成為普遍重視的研究熱點(diǎn)之一[9]。為此，本研究以野生絡(luò)石為試驗(yàn)材料，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，篩選鑒定具有顯著抑菌活性的微生物資源，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)生細(xì)菌的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年7月，筆者于洛陽(yáng)市天池山采集野生絡(luò)石完整植株作為試驗(yàn)材料。指示病原真菌：煙草黑脛病原（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）由洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院劉順通研究員惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

NA固體培養(yǎng)基：內(nèi)生細(xì)菌的分離和培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn)用。PDA培養(yǎng)基：病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn)用。LB液體培養(yǎng)基：生防菌菌懸液制備用。所有培養(yǎng)基在120℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min備用。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

將絡(luò)石流水沖洗20 min后，用75%乙醇浸泡2 min，無(wú)菌水漂洗3次，再用0.1%升汞二次浸泡消毒2 min，無(wú)菌水漂洗3次（取最后1次無(wú)菌水漂洗液涂板，無(wú)菌生長(zhǎng)作為是否消毒徹底的依據(jù)）。將消毒后的植株放入無(wú)菌研缽中5 mL無(wú)菌水研磨成漿，靜置5 min，用移液槍吸取60μL上清液，涂布NA平板中，28℃培養(yǎng)2～3 d。挑取典型菌落進(jìn)行劃線純化。

1.4 內(nèi)生菌抑菌活性篩選

1.4.1菌懸液的制備。將純化的內(nèi)生細(xì)菌接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取適量菌液于滅菌離心管中，12 000 r/min離心15 min，收集菌體，用無(wú)菌水懸浮并調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL，獲得菌株菌懸液[10]。

1.4.2 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)。采用牛津杯平板對(duì)峙法[11]，分別考察分離內(nèi)生細(xì)菌對(duì)指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌餅，距菌餅3 cm處左右對(duì)稱放置2個(gè)牛津杯，且每個(gè)牛津杯加注20μL制備好的內(nèi)生細(xì)菌菌懸液，以牛津杯注入無(wú)菌水為作為對(duì)照，做3次重復(fù)，然后置于28℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5～7 d，定期觀察生長(zhǎng)情況。

1.5 菌株的多相分類鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征測(cè)定。將測(cè)定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制樣進(jìn)行光鏡和掃描電鏡下的形態(tài)觀察[12]。生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[13-14]，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.5.2 菌株16S rDNA分析。將測(cè)定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜搖床培養(yǎng)，采用試劑盒提取基因組DNA；選用通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR體系及操作方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行比對(duì)，并采用MEGA7的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[15]。

1.6 目標(biāo)菌抑菌作用應(yīng)用試測(cè)實(shí)驗(yàn)

測(cè)試植株的制備：用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草黑脛病病原，并制備孢子懸液（血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)孢子數(shù)目，調(diào)整孢子濃度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子懸浮液于接種到植株根部，以無(wú)菌水處理為對(duì)照。26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光周期12 h黑暗交替。

將測(cè)試菌株用LB液體培養(yǎng)基32℃搖床培養(yǎng)至OD=4，然后12 000 r/min離心15 min收集菌體，再用等量無(wú)菌水懸浮菌體制得測(cè)試母液。施用方法：噴霧法（葉片完全濕潤(rùn)為標(biāo)準(zhǔn)）和灌根法（土表沿莖基部澆注5 mL）。施用時(shí)間：病原侵染2 d后。每處理3次重復(fù)，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，7 d后進(jìn)行葉片病情指數(shù)及發(fā)病率的調(diào)查。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

煙草黑脛病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，全株無(wú)?。?級(jí)，莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2，或半數(shù)以下葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；2級(jí)，莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2，或半數(shù)以上葉片凋萎；3級(jí)，莖部病斑環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；4級(jí)，病株全部葉片凋萎或枯死。

病情指數(shù)＝（∑各級(jí)病株或葉數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株或葉數(shù)×最高級(jí)值）×100；

防治效果（%）＝（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 絡(luò)石內(nèi)生細(xì)菌分離結(jié)果

絡(luò)石營(yíng)養(yǎng)體混合樣研磨涂布NA平板中，28℃培養(yǎng)2～3 d以后，平板上形成特征典型的菌落（圖1）。挑取菌落進(jìn)行3次劃線純化，共獲得31株細(xì)菌活體純培養(yǎng)物，依次編號(hào)為HHH12～HHH31。15%甘油于-20℃保種備用。

圖1 絡(luò)石內(nèi)生菌分離平板生長(zhǎng)情況

2.2 絡(luò)石內(nèi)生細(xì)菌生防活性菌株篩選結(jié)果

以煙草黑脛病原為指示菌，分別對(duì)獲得的31株絡(luò)石內(nèi)生細(xì)菌的拮抗活性進(jìn)行考察。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，HHH12菌株對(duì)煙草黑脛?。徊≡z具有明顯的抑制作用（圖2），抑菌圈直徑達(dá)到24 mm，初步將其定性為具有生防活性功能菌株。

圖2 菌株形成的抑菌圈

2.3 菌株HHH12的分類鑒定結(jié)果

將菌株HHH12在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察可見(jiàn)，菌落呈黃色，不透明，邊緣整齊，隆起明顯，表面濕潤(rùn)（圖3-A）。革蘭氏染色陰性，菌體呈直桿形，多單生，兩端鈍圓，具端鞭毛，長(zhǎng)介于2.3～3.6μm，直徑介于1.1～1.5μm（圖3-A，B）。

圖3 菌株HHH12的形態(tài)特征

菌株HHH12的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果：測(cè)定結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)的項(xiàng)目包括明膠水解試驗(yàn)試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、脲酶水解試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)；陰性反應(yīng)項(xiàng)目包括淀粉水解、甲基紅試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)。

菌株HHH12的16S rDNA序列分析結(jié)果：菌株HHH12的16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果為1 503 bp，序列提交GenBank獲得登錄號(hào)OL966065。在GenBank比對(duì)獲得同源性較高序列并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，菌株HHH12與Pseudomonas fluorescens（LS483372.1）、P.fluorescens（MT712234.1）和P.fluorescens（NR114476.1）聚為一支，相似度達(dá)到98%。結(jié)合菌株LZ-7的形態(tài)、生理生化和分子鑒定結(jié)果，將其鑒定為假單孢菌屬菌株，暫命名為Pseudomonassp.HHH12。

圖4 菌株HHH12的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 菌株HHH12的生防應(yīng)用效果

通過(guò)盆栽試驗(yàn)，考察菌株HHH12對(duì)煙草黑斑病的生物防治效果，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，HHH12菌懸液的灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種處理表現(xiàn)出不同的生防效果，整體而言，灌根+葉面噴霧混合處理在不同發(fā)病階段均表現(xiàn)出比葉面噴霧和灌根單一處理有更好的應(yīng)用效果，施藥后14 d時(shí)的防治效果達(dá)到72.86%，是灌根處理的1.09倍，是葉面噴霧處理的2.94倍。葉面噴霧和灌根相比較而言，后者優(yōu)于前者，14 d時(shí)的灌根處理的防治效果是葉面噴霧的2.71倍。3種施用方法的防治效果相互之間差異達(dá)顯著水平。驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HHH12菌株對(duì)煙草黑脛病的防治是有效的?？梢?jiàn)，單一灌根和灌根+葉面噴霧均具有較好的生防效果，單一葉面噴霧效果較差，不建議使用。

表1 菌株HHH12對(duì)花葉絡(luò)石葉斑病的防治效果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生菌是篩選功能微生物的一個(gè)重要來(lái)源。本研究采用NA培養(yǎng)基從野生絡(luò)石營(yíng)養(yǎng)體中分離得到31株內(nèi)生細(xì)菌活體純培養(yǎng)物，說(shuō)明野生絡(luò)石植株體內(nèi)生細(xì)菌資源多樣性豐富。如果不斷優(yōu)化和改變分離培養(yǎng)基類型，分離到更多種類的內(nèi)生菌是可能的。

絡(luò)石作為一種傳統(tǒng)中草藥植物，其核心功效是抑菌、抗痛。依據(jù)自然界生物的協(xié)同進(jìn)化原理和規(guī)律[16]，從絡(luò)石營(yíng)養(yǎng)體內(nèi)篩選出具有抑菌作用的生防菌也是可能的。本研究開(kāi)展的31株菌株對(duì)煙草黑脛病原的對(duì)峙試驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè)，其中菌株HHH12的平板對(duì)峙抑菌圈直徑達(dá)到24 mm，符合生防菌初篩判斷規(guī)律[4-5，18]。該菌株具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的前景。

在對(duì)菌株HHH12的多相鑒定中，菌株的形態(tài)特征和測(cè)定的生理生化特征指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道的假單孢菌屬特征描述基本吻合[13，17-18]，但16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示的菌株HHH12與同源菌種16S rDNA序列的相似度僅為96%，未達(dá)到鑒定到同種序列相似度大于98%的一般要求，故將菌株HHH12歸屬于假單孢菌屬，暫命名為Pseudomonassp.HHH12。

本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了菌株HHH12的生防活性，在灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種不同處理中，灌根+葉面噴霧的效果最好，單一灌根也取得了67.15%的防治效果?？梢?jiàn)，灌根處理配合葉面噴霧具有一定的增效作用，這可能與菌株HHH12的內(nèi)生特性有關(guān)，但不同功能微生物的發(fā)揮作用機(jī)制是極為復(fù)雜的，有待后續(xù)不斷深入研究。