凱氏定氮法檢測乳制品中蛋白質(zhì)含量的優(yōu)化方法

黃漫蓉，宋艷梅，范光彩，周 歡，錢成林*，夏忠悅，2

1 新希望乳業(yè)股份有限公司，四川成都 610023 2 乳品營養(yǎng)與功能四川省重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川成都 610023

0 引言

蛋白質(zhì)是乳制品的主要營養(yǎng)成分之一，是衡量乳制品質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[1，2]。目前檢測乳制品中蛋白質(zhì)的常見方法有凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法、紅外光譜法、雙縮尿法、甲醛滴定法、考馬斯亮藍(lán)法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等。但是從檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時(shí)性和檢測過程的安全性考慮，分光光度法和甲醛滴定法干擾物質(zhì)較多，準(zhǔn)確性差；燃燒法不能區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮；紅外光譜法需要定期校準(zhǔn)，檢測成分單一；雙縮尿法靈敏度差；精密度差；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳法所需要的檢測儀器操作復(fù)雜，需要檢測人員具備一定的專業(yè)技能[3～8]。

凱氏定氮法是一種比較常見的檢測方法，與其他方法相比較，凱氏定氮法最適宜用來檢測乳制品中蛋白質(zhì)含量，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較高，儀器操作簡單，使用者能快速掌握儀器的使用方法[9，10]。該方法主要步驟在消化和蒸餾，其中消化花費(fèi)的時(shí)間最長，檢測時(shí)的樣品稱樣量也各不相同，因此本文主要對凱氏定氮法檢測乳制品蛋白質(zhì)含量的過程進(jìn)行優(yōu)化，以能更好地開展檢測工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳特蘭純牛奶（滅菌乳）、新希望草莓味奶（調(diào)制乳）、悠質(zhì)原味風(fēng)味酸奶（發(fā)酵乳）、飯后半小時(shí)果蔬乳酸菌飲品（乳飲料），新希望乳業(yè)股份有限公司。

硫酸（優(yōu)級(jí)純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；蛋白質(zhì)催化劑片（硫酸銅+硫酸鉀），福斯華（北京）科技貿(mào)易有限公司；0.05 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（SRM），深圳市博林達(dá)科技有限公司；硼酸（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；溴甲酚綠（指示劑），成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲基紅（指示劑），成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KjeltecTM 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀、LabtecTM Line 消化爐，福斯華（北京）科貿(mào)有限公司；電子天平（感量：0.1 mg），梅特勒-托利多儀器公司；UPR-Ⅱ-20L 純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配制

1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液：稱取0.1 g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

1 g/L甲基紅乙醇溶液：稱取0.1 g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

10 g/L硼酸溶液：稱取10 g硼酸，加超純水溶解并稀釋至1 000 mL，加入7 mL甲基紅乙醇溶液，10 mL溴甲酚綠乙醇溶液混合均勻，取30 mL配制好的硼酸溶液加100 mL純水，顏色呈淺灰色，若偏紅則用0.1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)，若偏綠則用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)。

400 g/L氫氧化鈉溶液：稱取400 g固體氫氧化鈉，加水溶解后放冷，并稀釋至1 000 mL。

1.3.2 樣品檢測

稱取混合均勻的一定量樣品（精確至0.000 1 g）至250 mL消化管中，放入1 粒蛋白質(zhì)催化劑，加入12 mL濃硫酸，混勻后于消化爐上消化，設(shè)置消化時(shí)間及消化溫度，待消化結(jié)束時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀，取出待冷卻至室溫，于全自動(dòng)凱氏定氮儀上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程[11]。

1.3.3 蒸餾條件

使用全自動(dòng)凱氏定氮儀，蒸餾條件設(shè)置為：稀釋液（超純水）70 mL、堿液（400 g/L氫氧化鈉溶液）60 mL、接收液（10 g/L硼酸溶液）30 mL。

1.3.4 優(yōu)化方案

（1）分別稱取滅菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、乳飲料各1 g、2 g、3 g、4 g、5 g，試樣在相同條件消化蒸餾，比對不同的稱樣量對檢測結(jié)果的影響。

（2）稱取同一質(zhì)量的滅菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、乳飲料，比對不同的消化時(shí)間（40 min、60 min、80 min、100 min、150 min）對檢測結(jié)果的影響。

（3）消化后的樣品及時(shí)冷卻一段時(shí)間后再使用凱氏定氮儀蒸餾滴定，比對不同的冷卻時(shí)間（0.5 h、4 h、24 h、48 h）對檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 稱樣量優(yōu)化

稱取滅菌乳、發(fā)酵乳、調(diào)制乳、乳飲料不同的稱樣量進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，對于混合均勻的乳制品，一定范圍內(nèi)稱樣量對結(jié)果的影響不大，精密度均符合《GB 5009.5—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》的要求，但是滅菌乳、調(diào)制乳、飲料稱樣量增多，精密度對應(yīng)越好，發(fā)酵乳則稱樣量過多后精密度有所下降。

表1 滅菌乳不同稱樣量測定結(jié)果

2.2 消化時(shí)間優(yōu)化

分別稱取滅菌乳、發(fā)酵乳、調(diào)制乳、乳飲料5 g，每個(gè)樣品進(jìn)行4 平行試驗(yàn)，先在230 ℃消化30 min，后420 ℃消化。根據(jù)牛奶蛋白質(zhì)檢測結(jié)果綜合分析，在420 ℃時(shí)消化80 min，可消化完全，精密度可以控制在1%以內(nèi)。結(jié)果如表2所示。

表2 不同消化時(shí)間檢測結(jié)果

2.3 冷卻時(shí)間優(yōu)化

分別稱取滅菌乳、發(fā)酵乳、調(diào)制乳、乳飲料，每個(gè)樣品進(jìn)行2 平行試驗(yàn)，一起消化后冷卻不同的時(shí)間后，再使用凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾滴定，結(jié)果如表3所示，48 h內(nèi)，檢測結(jié)果沒有顯著差異。所以在消化結(jié)束后可以根據(jù)試驗(yàn)者安排，合理規(guī)劃后續(xù)試驗(yàn)時(shí)間，不用必須接著進(jìn)行蒸餾滴定操作。

表3 消化后樣品冷卻不同時(shí)間的蛋白質(zhì)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在采用國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上使用凱氏定氮法檢測牛奶中蛋白質(zhì)含量，對于混合均勻的樣品，不同的稱樣量對檢測結(jié)果影響不大，樣品在230 ℃消化30 min后繼續(xù)在420 ℃消化80 min，能消化完全且精密度好；消化后樣品的冷卻時(shí)間不影響其檢測結(jié)果。