超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿與尿液中14種麻痹性貝類毒素

林 強(qiáng), 楊 超, 李美麗, 王 佳, 侯瀚然, 邵 兵, 牛宇敏*

(1. 北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 北京 102100; 2. 北京市疾病預(yù)防控制中心, 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100013)

麻痹性貝類毒素(PSP)是由藻類產(chǎn)生的一類四氫嘌呤類化合物[1],具有極性強(qiáng)、堿性條件下易氧化、不易被消化酶破壞等特點(diǎn)[2]。自然界中的PSP主要包括3類:(1)氨基甲酸酯類毒素,如石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素等(NEO); (2)去氨甲?；惗舅?如脫氨甲?；扛蚨舅?DCSTX)、脫氨甲?；率扛蚨舅?DCNEO)等;(3)N-磺酰氨甲?；惗舅?如N-磺酰氨甲酰膝溝藻毒素1(GTX1)、N-磺酰氨甲酰膝溝藻毒素2(GTX2)等。食用被PSP污染的貝類樣品后的幾分鐘至幾個(gè)小時(shí)就會出現(xiàn)口腔和四肢麻木刺痛以及惡心嘔吐等胃腸道癥狀,嚴(yán)重者可以危及生命。PSP的人體中毒劑量為108～900 μg STX eq/100 g,致死劑量為540～5 400 μg STX eq/100 g[2]。GB 2733-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定,PSP的限量為80 μg STX eq/100 g貝類。

PSP食物中毒很難診斷,通常是通過測定食用貝類的殘留物來確定。然而在很多中毒事件中無法獲得食物的殘留物,且貝類樣品中毒素的濃度分布不均,可能導(dǎo)致對毒素的嚴(yán)重低估或高估。通過對中毒病人血液或尿液等生物樣品中毒素的檢測來診斷中毒原因是一種強(qiáng)有力的手段。相關(guān)研究表明,PSP進(jìn)入人體后在血漿[3,4]中主要以化合物原型存在,并以原型通過尿液[5-10]排出體外。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn),目前已基于LC-MS/MS建立了貝類中多種PSP同時(shí)檢測的方法[11-14]。關(guān)于血液和尿液中PSP的檢測方法研究目前非常有限,僅集中在STX和NEO兩種毒素,尿液[5,10]中STX和NEO的檢出限為1.00～5.10 μg/L,血漿[3]中NEO的檢出限為0.40 μg/L,存在方法檢出限高、前處理流程復(fù)雜等問題,不能滿足突發(fā)事件的快速檢測需求。因此,亟須建立操作簡便快速、高靈敏度、多種化合物同時(shí)檢測的方法,以便于快速鎖定中毒因子,為臨床救治提供技術(shù)支持。

本研究以14種PSP為研究對象,分別采用液液萃取和聚酰胺(PA)固相萃取柱對樣品進(jìn)行前處理,優(yōu)化了尿液樣品凈化流程,有效降低了基質(zhì)效應(yīng)影響,結(jié)合極性色譜柱對目標(biāo)物進(jìn)行分離,建立了血漿和尿液中14種PSP快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法,為貝類食物中毒事件的快速處置提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

SCIEX Exion LC超高效液相色譜儀、SCIEX QTRAP 6500+質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司); Centrifuge 5810 R冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司); Milli-Q IQ 7005超純水器(美國Millipore公司); JXA5003 PA固相萃取柱(天津艾杰爾公司)。

甲醇、乙腈(質(zhì)譜級)購自美國Sigma Aldrich公司;甲酸(優(yōu)級純)購自中國Dikma公司;14種麻痹性貝類毒素:GTX1(23.5 mg/L)、GTX2(40.6 mg/L)、膝溝藻毒素3(GTX3)(17.2 mg/L)、膝溝藻毒素4(GTX4)(7.4 mg/L)、膝溝藻毒素5(GTX5)(21.1 mg/L)、膝溝藻毒素6(GTX6)(4.94 mg/L)、脫氨甲酰基膝溝藻毒素2(DCGTX2)(35.3 mg/L)、脫氨甲酰基膝溝藻毒素3(DCGTX3) (10.4 mg/L)、N-磺酰氨甲酰膝溝藻毒素1(C1)(53.8 mg/L)、N-磺酰氨甲酰膝溝藻毒素2(C2)(16.1 mg/L)、STX(24.7 mg/L)、DCSTX(21.4 mg/L)、NEO(20.5 mg/L)、DCNEO(10.1 mg/L),均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取1.1節(jié)中14種麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于20 mL容量瓶中,純水定容,得到麻痹性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。密封儲存于-18 ℃冰箱。使用時(shí)根據(jù)需要配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3 樣品采集

由于未獲得中毒病人的尿液和血漿,為獲得陽性樣品,本研究采用小鼠腹腔注射14種PSP后收集小鼠的血漿和尿液。吸取14種PSP混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液5 mL,腹腔注射4 h后使用代謝籠收集小鼠尿液,小鼠尾靜脈取血收集小鼠血漿。小鼠血漿和尿液樣品均保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 樣品前處理

1.4.1尿液樣品制備

準(zhǔn)確吸取0.2 mL尿液樣品,依次加入0.2 mL水、0.4 mL甲醇和0.6 mL乙腈后渦旋混勻,12 000 r/min離心5 min,吸取0.7 mL上清液,加入預(yù)先經(jīng)2 mL乙腈-水(50∶50, v/v)和2 mL乙腈活化的PA固相萃取柱中,棄去流出液,加入2 mL含0.1%甲酸的乙腈-水(80∶20, v/v)溶液洗脫,收集洗脫液,過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測。

1.4.2血漿樣品制備

取0.2 mL血漿,依次加入0.2 mL水、0.4 mL甲醇、0.6 mL乙腈后渦旋1 min,以12 000 r/min離心5 min,吸取0.4 mL上清液,過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),柱溫:35 ℃;流動相A:含0.1%(v/v)甲酸的5 mmoL/L甲酸銨緩沖溶液,流動相B:含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液;流速:0.5 mL/min;梯度淋洗程序:0～0.5 min, 13%A; 0.5～5.5 min, 13%A～30%A; 5.5～6.0 min, 30%A～50%A; 6.0～7.5 min, 50%A; 7.5～8.0 min, 50%A ～13%A; 8.0～12.0 min, 13%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源;離子源溫度:550 ℃;掃描方式:正離子和負(fù)離子同時(shí)切換掃描;噴霧電壓:5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-);氣簾氣壓力:0.24 MPa;霧化氣壓力GS1和輔助加熱器壓力GS2:0.38 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集。其他質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間見表1。

表1 14種麻痹性貝類毒素的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

PSP極性較強(qiáng)(logKow值處于-4.03～-1.22),使用反相色譜柱無法對其進(jìn)行保留。本研究選取了Poroshell 120 HILIC-Z親水性色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),對流速、流動相以及梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,按照1.5.1節(jié)色譜條件開展實(shí)驗(yàn),14種PSP毒素分離效果良好(見圖1),可以準(zhǔn)確進(jìn)行定性定量分析。

圖1 14種麻痹性貝類毒素(2.5 μg/L)的MRM色譜圖

2.2 固相萃取柱的選擇

參考文獻(xiàn)[7,10]，使用0.2 mL水、0.4 mL甲醇、0.6 mL乙腈混合溶液對尿液和血漿樣本進(jìn)行提取,血漿樣本加標(biāo)回收率為71.4%～114.9%,尿液樣本加標(biāo)回收率為40.1%～116.7%。除回收率外,在LC-MS/MS的分析中,基質(zhì)效應(yīng)是評估方法的另一個(gè)重要指標(biāo)。本文中基質(zhì)效應(yīng)以ME=空白基質(zhì)樣品凈化提取液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×100%計(jì)算,當(dāng)ME>100%,表明基質(zhì)增強(qiáng),ME<100%,表明基質(zhì)抑制。直接采用上述溶劑提取后,血漿樣本的基質(zhì)效應(yīng)為97%,接近100%,表明該方法對于血漿樣本基質(zhì)效應(yīng)較小。然而尿液樣本中含有極性強(qiáng)的鹽類,直接提取會帶來較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),STX、DCSTX、NEO、DCNEO 4種化合物的基質(zhì)效應(yīng)在500%～810%之間,具有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),因此需要進(jìn)一步使用固相萃取柱去除尿液樣品中的無機(jī)鹽。

石墨化炭黑固相萃取柱對于極性和非極性化合物都具有良好的親和性,常用于貝類樣品中PSP的檢測[15,16], PA固相萃取柱由酰胺聚合而成,其中的酰胺鍵可以與其他極性鍵基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵[7],被用于尿液中STX和NEO兩種毒素的檢測。本研究對比了石墨化炭黑固相萃取柱和PA固相萃取柱對尿液樣品提取液的凈化效果(見圖2)。結(jié)果表明,使用石墨化炭黑固相萃取柱對尿液樣品進(jìn)行凈化處理,STX、DCSTX、NEO、DCNEO 4種化合物仍然表現(xiàn)出很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)在450%～750%之間,且4種化合物的樣品加標(biāo)回收率均低于50%。采用PA固相萃取柱對尿液樣品進(jìn)行凈化處理后,14種化合物方法的回收率在91.2%～95.0%之間,基質(zhì)效應(yīng)在90%～120%之間,表明該固相萃取柱對14種水溶性貝類毒素均有良好的凈化作用。本研究最終選擇PA固相萃取柱對尿液進(jìn)行凈化處理。

圖2 不同的固相萃取柱對尿液中14種麻痹性貝類毒素加標(biāo)回收率(n=6)和基質(zhì)效應(yīng)的影響

2.3 固相萃取柱凈化方法的優(yōu)化

在文獻(xiàn)[10]基礎(chǔ)上,本研究對洗脫液的組分進(jìn)行了優(yōu)化。首先,對比了含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(80∶20, v/v)和乙腈-水(80∶20, v/v)兩種洗脫溶液的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用乙腈-水(80∶20, v/v)洗脫時(shí),14種水溶性貝類毒素加標(biāo)回收率在71.2%～75.3%之間,低于使用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(80∶20, v/v)洗脫時(shí)81.1%～96.5%的加標(biāo)回收率。

其次,對比了含0.1%(v/v)甲酸的乙腈與水的體積比分別為50∶50、70∶30、80∶20和90∶10時(shí)4種洗脫溶液的洗脫效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖3),隨著乙腈比例從50%升高至80%,目標(biāo)物的回收率從56.1%～60.2%升高到81.1%～96.5%。當(dāng)乙腈比例進(jìn)一步從80%升高到90%,目標(biāo)物的回收率沒有進(jìn)一步改善。因此,最終確定使用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(80∶20, v/v)洗脫P(yáng)A固相萃取柱。

圖3 不同比例的洗脫液對尿液中14種麻痹性貝類毒素加標(biāo)回收率的影響(n=6)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性范圍、檢出限與定量限

按照1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見表2)。結(jié)果顯示,14種化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。

表2 14種麻痹性毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 (續(xù))

在空白尿液和空白血漿樣品中分別進(jìn)行低水平加標(biāo)試驗(yàn),以3倍和10倍信噪比分別確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),具體結(jié)果見表2。尿液檢測的定量限為4.80～34.40 μg/L,血漿檢測的定量限為1.68～12.04 μg/L。尿液和血漿樣品的定量限均優(yōu)于相關(guān)檢測方法[3,5,10]的定量限(具體數(shù)據(jù)見表3)。

2.4.2方法的準(zhǔn)確度和精密度

分別取空白尿液和空白血漿進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平分別為LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ,每個(gè)水平制備6份平行樣品。以同一天6份樣品平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日內(nèi)精密度,以連續(xù)5天樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日間精密度。以樣品的加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確度。按照1.4節(jié)方法處理樣品,方法的回收率為70.4%～123.4%,日內(nèi)精密度為2.3%～19.1%,日間精密度為4.0%～16.2%(見表4),表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5 樣品的測定

使用本研究建立的方法檢測小鼠的血漿和尿液樣本,在20份小鼠尿液和血漿樣本中均檢測到14種麻痹性貝類毒素,含量分別為19.40～55.60 μg/L和8.75～13.86 μg/L(見表5)。

表5 血漿和尿液樣本中14種麻痹性毒素的濃度

3 結(jié)論

本研究對血漿、尿液的前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化,血漿經(jīng)過簡單的液液萃取,尿液經(jīng)過優(yōu)化的固相萃取流程,即可上機(jī)檢測14種麻痹性貝類毒素化合物。該研究建立的方法具有目標(biāo)化合物種類多、操作簡便、靈敏度高的特點(diǎn),適合發(fā)生食物中毒時(shí)快速開展尿液、血漿中多種毒素的篩查、定量工作。