靈芝-巴豆雙向發(fā)酵品工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

陸賽健，張洵浩，周迎蕾，王歆竹，胡 珀，郭 亮，陳 景，楊光明，鐘 蕾，潘 揚

（南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023）

巴豆為大戟科植物巴豆（Croton tigliumL.）的干燥成熟果實，又稱剛子、巴菽或者雙眼龍等。其性熱，味辛，內(nèi)服用于治療寒結(jié)便秘、腹水腫脹等，外用可以治療惡瘡疥癬［1-2］。靈芝（Ganoderma lucidum）是一種珍貴的食藥用真菌，具有抗腫瘤［3］、保護心腦缺血［4］、抗病毒［5］和抗阿茲海默癥［6］等藥理作用。靈芝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中華人民共和國藥典》記載其為赤芝、紫芝的干燥子實體；其中赤芝主治胸中結(jié)，可益心氣、補中，對心腦血管疾病引起的心悸或者心律不齊等效果較好［7］。雙向發(fā)酵是一種新的中草藥發(fā)酵技術(shù)，中藥在提供真菌生長所需營養(yǎng)的同時，又能受到真菌中酶的作用改變中藥自身成分，產(chǎn)生新的性味功能，從而使整個發(fā)酵作用具有雙向性［8-9］。在各項研究中發(fā)現(xiàn)這種發(fā)酵對中藥材有解毒、增效和擴大適應癥等作用［10-11］。

眾多研究表明，靈芝菌作為雙向發(fā)酵菌種具有很強的優(yōu)越性，目前靈芝-中藥雙向發(fā)酵的研究主要集中于發(fā)酵物的化學成分測定及中藥減毒增效等方面［12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巴豆經(jīng)靈芝菌發(fā)酵后，其毒性成分脂肪油和毒蛋白的含量明顯降低［13］，毒性也有了明顯的下降［14］。但目前巴豆與靈芝雙向發(fā)酵的研究只在于混合物，未對發(fā)酵前后含量變化的成分進行研究。

“靈巴菌質(zhì)”為巴豆與靈芝雙向發(fā)酵品。本研究在“靈巴菌質(zhì)”中檢測到腺苷，其含量與前期在巴豆中檢測到的腺苷相比有所增加。腺苷（Adenosine）是由腺嘌呤的N-9與D-核糖的C-1通過β糖苷鍵連接而成的內(nèi)源性嘌呤類核苷［14］，其具有抗病毒、抗氧化［15］、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［16］、抗癲癇及保護心臟和腎臟［17］等作用?！办`巴菌質(zhì)”中腺苷含量相對較低。因此，本研究對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，以期提高發(fā)酵品中腺苷的含量，同時對巴豆和發(fā)酵品“靈巴菌質(zhì)”的抗氧化效果進行了評價。本研究為腺苷的開發(fā)及綜合利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴豆購于南京鹿江中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學潘揚研究員鑒定為大戟科植物巴豆（Croton tig-liumL.）的果實；多孔菌科真菌赤芝［Ganoderma lucidum（Curtis： Fr.） P. Karst］由本實驗室保存；“靈巴菌質(zhì)”為巴豆與靈芝菌的發(fā)酵品。葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、酵母提取液、瓊脂、水楊酸、K3［Fe（CN）6］、C2HCl3O2、FeCl3、FeSO4均為分析純，購自國藥集團；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 購自上海凌峰化學試劑有限公司；DPPH自由基清除能力試劑盒購自南京建成生物工程。

VS-1300L-V超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；THZ-D恒溫震蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）；TD20002C電子天平（天津天馬衡儀器）；LHP-250H智能人工氣候培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；CS-700粉碎機（永康市天琪盛世工貿(mào)有限公司）；EnVision多功能酶標儀（珀金埃爾默上海有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent C18色譜柱（美國Agilent公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，121℃滅菌20 min，用于菌種擴大培養(yǎng)。

靈芝菌種子液：葡萄糖20.0 g，酵母粉5.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO41.5 g，蒸餾水1.0 L，121℃滅菌30 min，用于種子液的制備。

1.2.2 液體菌種制備

用接種針從活化的靈芝菌斜面上切取3～4塊1 cm3菌塊，接入種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，于180 r/min，28℃條件下培養(yǎng)6～7 d。

1.2.3 單因素實驗

分別考察溫度（22、25、28、31、34℃）、巴豆粉碎粒徑（6、10、24、40、80目）、靈芝接種量（0.1、0.15、0.20、0.25、0.3 mL/g）、發(fā)酵時間（9、12、15、18、21、24、27、30 d）、初始含水量（50%、60%、70%、80%、90%、100%）、發(fā)酵pH（4、5、6、7、8）對腺苷產(chǎn)量的影響。若無特殊說明，固定水平為巴豆粉碎粒徑為10目，接種量0.15 mL/g，溫度28℃，初始含水量70%，發(fā)酵pH7，發(fā)酵30 d［18］。

1.2.4 Plackett-Burman實驗

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以腺苷的含量為響應值，對發(fā)酵溫度、巴豆粉碎粒徑、接種量、發(fā)酵時間、初始含水量、發(fā)酵pH進行篩選，篩選出關(guān)鍵因子。每個因素取兩個水平，分別用1和-1表示，共12組實驗。實驗因素水平及編碼見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素水平及編碼Tab.1 Level and code of variables chosen for Plackett-Burman design

1.2.5 響應曲面優(yōu)化

經(jīng)過Plackett-Burman實驗，篩選出發(fā)酵時間、pH、接種量及初始含水量為關(guān)鍵因素。隨后以腺苷的含量為響應值，自變量為四個關(guān)鍵因素，進行4因素3水平的響應面分析實驗。用Design Expert 10軟件對Box-Behnken實驗進行設(shè)計，并對實驗結(jié)果進行響應面分析，最終確定最佳工藝參數(shù)。每個自變量的低、中、高水平分別用-1、0、1編碼，Box-Behnken實驗設(shè)計因素與水平見表1。

表2 響應面分析法實驗設(shè)計因子水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.2.6 腺苷測定

待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物“靈巴菌質(zhì)”于60℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩。稱取0.5 g靈巴菌質(zhì)粉末，至于5 mL無菌管中，加入蒸餾水3 mL，于30℃、500 W超聲提取3 h，冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min，分離得到上清液。將上清液經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜后經(jīng)液相測定腺苷含量。以不同濃度腺苷溶液繪制標準曲線，確定回歸方程為：y=41 116x+147.83，R2=0.999，具有良好的線性關(guān)系。

腺苷含量（mg/g）=（x - 147.83）/ 41 116 × 6

其中，x為峰面積。

液相條件：流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：5%A→10%A（0→15 min），10%A→15%A（15→25 min），15%A→20%A（25→30 min），20%A→30%A（30→35 min），30%A→95%A（35→40 min），95%A→5%A（40→50 min）［18］。流速為 1 mL/min，檢測波長260 nm，進樣量20 μL。

1.2.7 抗氧化測定方法

水提液：分別準確稱取10 g巴豆和靈巴菌質(zhì)粉末于三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，85℃超聲提取兩次，每次30 min，過濾，合并兩次提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

醇提液：分別準確稱取10 g巴豆和靈巴菌質(zhì)粉末于三角瓶中，加入50 mL 75%乙醇，65℃超聲提取兩次，每次30 min，過濾，合并兩次提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.1 還原力測定

取1 mL的樣品，加入2.5 mL的濃度為0.2 mol/L，pH為6.6的磷酸緩沖液，搖勻后加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液。將混合物放入50℃水浴，恒溫加熱20 min后，加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液。在2.5 mL的反應液中，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL氯化鐵溶液（0.1%）。在700 nm處測定吸光度值。溶液的吸光度值越高則還原性越強。

1.2.7.2 DPPH自由基清除率測定

根據(jù)DPPH自由基清除能力試劑盒，向離心管中加入不同比值的溶液，混勻，室溫25℃避光靜置30 min，4 000 r/min離心5 min，在波長517 nm下進行檢測。

清除率（%）=［1 -（A測定 - A對照）/ A空白］×100%

1.2.7.3 羥基自由基清除率測定

吸取一定濃度的樣品溶液1 mL，分別加入1 mL 9.0 mmol/L的FeSO4溶液1 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL 8.8 mmol/L 的 H2O2、蒸餾水1 mL，置于37℃水浴中30 min，在510 nm波長處測定其吸光值A(chǔ)1；用蒸餾水代替H2O2，得本底吸收A2，蒸餾水代替樣品溶液，得空白值A(chǔ)3；實驗以蒸餾水作為參比。按照以下公式計算清除率。

清除率（%）=［1 -（A1 - A2）/ A3］× 100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次。通過GraphPad Prism 8對單因素實驗的實驗結(jié)果進行作圖，采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析；通過Design Expert 10軟件對關(guān)鍵因子實驗和響應面實驗進行設(shè)計、數(shù)據(jù)處理、作圖及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對腺苷含量的影響

隨著溫度的上升，腺苷的含量先上升后降低。在28℃發(fā)酵組中，其含量達到最高值，為1.39 mg/g（圖1）。靈芝的最佳生長溫度在28℃左右，超過最佳生長溫度，靈芝菌絲體細胞中的蛋白質(zhì)和核酸等將受到不可逆的破害，靈芝菌的生長受到影響［19］，從而靈芝與巴豆發(fā)酵不充分，導致腺苷含量較少。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對腺苷含量具有顯著影響（P＜0.05）。因此，選溫度25～31℃作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖1 發(fā)酵溫度對腺苷含量的影響Fig.1 The effects of fermentation temperatures on the contents of adenosine

2.1.2 巴豆粉碎粒度對腺苷含量的影響

在巴豆粒徑為10目時，腺苷含量達到最高值，隨后呈下降趨勢（圖2）。在固體發(fā)酵過程中，中藥顆粒的大小會直接影響其與菌絲體的接觸面積，以及發(fā)酵過程中氧供給率、CO2移除率以及散熱率［20］。方差分析結(jié)果表明，巴豆粉碎粒度對腺苷含量具有顯著影響（P＜ 0.05）。因此，選粉碎粒度6～24目作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖2 巴豆粉碎粒度對腺苷含量的影響Fig.2 The effects of crushing sizes on the contents of adenosine

2.1.3 靈芝接種量對腺苷含量的影響

在0.1～0.3 mL/g的范圍內(nèi)，腺苷的含量隨著接種量的升高而顯著增加。在接種量為0.25 mL/g時，其含量達到最高值，為1.61 mg/g，隨后呈下降趨勢（圖3）。菌種接種量過大造成生長環(huán)境所提供的營養(yǎng)素不足，導致部分菌絲通過消耗自身的多糖來維持生命活動［21］，因此當菌種接種量提升時目標物質(zhì)含量反而降低。方差分析結(jié)果表明，靈芝接種量對腺苷含量具有顯著影響（P＜ 0.05）。因此，選接種量0.2～0.3 mL/g作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖3 接種量對腺苷含量的影響Fig.3 The effects of inoculation quantities on the contents of adenosine

2.1.4 發(fā)酵時間對腺苷含量的影響

不同的發(fā)酵時間對腺苷含量呈現(xiàn)出一定的影響，隨著發(fā)酵天數(shù)增加，腺苷含量增加。在靈芝與巴豆雙向發(fā)酵時間為27 d時，腺苷的產(chǎn)量達到最大值，為1.35 mg/g，當發(fā)酵天數(shù)大于27 d，腺苷的產(chǎn)量呈下降趨勢（圖4）。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時間對腺苷含量具有顯著影響（P＜ 0.05）。因此，選發(fā)酵時間24 ～30 d作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖4 發(fā)酵時間對腺苷含量的影響Fig.4 The effects of fermentation times on the contents of adenosine

2.1.5 初始含水量對腺苷含量的影響

在發(fā)酵過程中，不同的初始含水量對腺苷的含量有著明顯的影響。初始含水量太少，靈芝菌的生長過程中得不到充足的水分，使得其生長緩慢，發(fā)酵不充分；初始含水量過高，會產(chǎn)生靈芝菌不向瓶底生長的現(xiàn)象，也得不到充分發(fā)酵，從而導致腺苷含量較少，故初始含水量為80%最為適宜（圖5）。方差分析結(jié)果表明，初始含水量對腺苷含量具有顯著影響（P＜ 0.05）。因此，選初始含水量70%～90%作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖5 初始含水量對腺苷含量的影響Fig.5 The effects of initial moisture contents on the contents of adenosine

2.1.6 發(fā)酵pH對腺苷含量的影響

發(fā)酵pH為5.0時，腺苷的含量最高，此后其含量隨著pH的升高而下降（圖6）。分析原因可知，微生物的生長可能會受到pH的影響，靈芝菌一般生長于酸性條件下，最適pH為5.0～6.0。超過最適pH，靈芝菌絲細胞內(nèi)的酶活性和細胞膜溫度性受到影響，從而影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［22］，可能導致腺苷的生物轉(zhuǎn)化率降低，含量減少。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵pH對腺苷含量具有顯著影響（P＜ 0.05）。因此，選發(fā)酵pH4～6作為關(guān)鍵因子篩選實驗的水平范圍。

圖6 pH對腺苷含量的影響Fig.6 The effects of pH on the contents of adenosine

2.2 關(guān)鍵因子的確定

用Minitab軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到的回歸方程為Y=1.548+0.048X1+0.016X2+0.141X3+0.066X4+0.156X5-0.053X6，R2=93.21%，表示該回歸模型的擬合度好，R2adj=85.05%，表示模型適用于85.05%的效應值。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應值Tab.3 Experimental design and response values of Plackett-Burman

由表4中的結(jié)果可知，影響腺苷含量的關(guān)鍵因素依次為：初始含水量X5＞接種量X3＞發(fā)酵時間X4＞發(fā)酵pHX6＞發(fā)酵溫度X1＞巴豆粉碎力度X2。故選擇初始含水量、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH這四個關(guān)鍵因素進一步做響應面優(yōu)化設(shè)計和分析。結(jié)合單因素結(jié)果，將發(fā)酵溫度和巴豆粉碎力度這兩個因素分別固定為28℃和10目。

2.3 響應面實驗結(jié)果

Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。通過Design-Expert 10軟件對表4中的4個因素和腺苷含量Y進行數(shù)據(jù)擬合，得到Y(jié)對發(fā)酵時間（A）、pH（B）、接種量（C）及初始含水量（D）的多元回歸方程：Y=2.074-0.015A-0.011B+0.013C+0.016D-0.01AC+0.01AD-0.005BC-0.0075BD-0.005CD-0.094A2-0.258B2-0.164C2-0.393D2。

表4 Plackett-Burman實驗設(shè)計各因素效應評價Tab.4 Effect evaluation of each factor under the Plackett-Burman test design

表5 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Tab.5 Design and results of Box-Behnken experiment

進一步對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表6。模型F值為246.78，P＜0.000 1，表明回歸模型是顯著的，不同處理之間的差異也是極明顯的。失擬項P=0.294 1＞0.05，表明失擬項不顯著，回歸方程模型與實際實驗擬合性較好，誤差較小。在回歸模型中，一次項A、D、C對腺苷的產(chǎn)量影響顯著（P＜ 0.05），二次項A2、B2、C2、D2對腺苷的產(chǎn)量影響極為顯著（P＜ 0.000 1），而一次項pH（B）以及交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對腺苷產(chǎn)量無顯著影響。各因素對于腺苷含量的影響顯著程度排序為：初始含水量（D）＞發(fā)酵時間（A）＞接種量（C）＞pH值（B）。

表6 回歸模型方差分析Tab.6 Regression model analysis of variance

由Design-Exper 10軟件對回歸模型進行優(yōu)化分析得到腺苷產(chǎn)量的最佳條件為：發(fā)酵時間27 d，pH5，接種量為2.5 mL/10 g，初始含水量為80%，在此條件下，預測所得到的腺苷最大理論值為2.1 mg/g。

2.5 最佳工藝的驗證

根據(jù)上述的最佳工藝條件，再結(jié)合發(fā)酵溫度為28℃，巴豆粉粹粒徑為10目，本實驗進行了3次平行的驗證實驗，得到腺苷的平均含量為2.07 mg/g，標準差為0.028。這與預測值2.1 mg/g相對誤差較小，差異不顯著，表明模型建立良好。

2.6 抗氧化結(jié)果

2.6.1 還原力

在巴豆和“靈巴菌質(zhì)”水提取物濃度為50 mg/mL時，巴豆水提物的還原力為0.712，“靈巴菌質(zhì)”水提物的還原力為0.909，“靈巴菌質(zhì)”水提物的還原力明顯強于巴豆水提物（圖7-A）。在30～60 mg/mL濃度范圍內(nèi)，“靈巴菌質(zhì)”醇提物的還原力增長較快，而巴豆醇提物的還原力增長較緩慢，且前者的還原力始終大于后者（圖7-B）。

圖7 巴豆和“靈巴菌質(zhì)”的還原力Fig.7 Reducing power of C.tiglium and “Lingba Junzhi”

2.6.2 DPPH自由基清除能力

在濃度為60 mg/mL時，“靈巴菌質(zhì)”水提物的DPPH自由基清除率為94.60%，IC50為10.80 mg/mL；巴豆水提物的DPPH自由基清除率為71.15%，IC50為20.56 mg/mL；“靈巴菌質(zhì)”醇提物的DPPH自由基清除率為85.12%，IC50為11.25 mg/mL；巴豆醇提物的DPPH自由基清除率為49.06%，且未達到IC50抑制水平（圖8）?？梢?，“靈巴菌質(zhì)”的DPPH自由基清除能力優(yōu)于巴豆。

圖8 巴豆和靈巴菌質(zhì)的DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH scavenging rate of C. tiglium and “Lingba Junzhi”

2.6.3 羥自由基清除能力

在濃度為60 mg/mL時，“靈巴菌質(zhì)”水提物的羥自由基清除率為69.87%，IC50為31.82 mg/mL；巴豆水提物的羥自由基清除率為57.58%，IC50為54.43 mg/mL；“靈巴菌質(zhì)”醇提物的羥自由基清除率為60.73%，IC50為45.47 mg/mL；巴豆醇提物的羥自由基清除率為48.29%，且未達到IC50抑制水平?？梢?，“靈巴菌質(zhì)”的羥自由基清除能力優(yōu)于巴豆，水提物的羥自由基清除率大于醇提物（圖9）。

圖9 巴豆和靈巴菌質(zhì)的羥自由基清除率Fig.9 Hydroxyl radicals scavenging of C. tiglium and “Lingba Junzhi”

3 結(jié)論與討論

本試驗在“靈巴菌質(zhì)”中檢測到腺苷，其含量與前期在巴豆中檢測到的相比，有所增加。但與冬蟲夏草和蛹蟲草中的腺苷含量相比，“靈巴菌質(zhì)”中腺苷含量相對較低［23-24］。因此本試驗對增加“靈巴菌質(zhì)”中腺苷的含量進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間27 d，pH5，接種量為0.25 mL/g，初始含水量為80%，發(fā)酵溫度為28℃，巴豆粉碎粒徑為10目，在此條件下的腺苷的含量為2.07 mg/g。與初始發(fā)酵工藝所得到1.10 mg/g相比，腺苷的含量提高187.8%，優(yōu)化效果顯著，表明對其生產(chǎn)具有一定的實用價值。

本試驗也對巴豆和“靈巴菌質(zhì)”的抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明“靈巴菌質(zhì)”的水提取物和醇提取物的還原力、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均強于巴豆。可能是因為發(fā)酵期間靈芝次生代謝產(chǎn)生的各種酶使基質(zhì)中的有效成分暴露出來了所導致的。

以上僅是本課題現(xiàn)階段的研究成果，還存在著腺苷具有較強的抗氧化活性，“靈巴菌質(zhì)”抗氧化能力增強是否與腺苷相關(guān)，或與其他哪些成分相關(guān)等不足。本試驗結(jié)果提供了一種高效提高巴豆-靈芝發(fā)酵品中腺苷含量的方法，為腺苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)，也為進一步深度開發(fā)巴豆資源提供了一種新思路，為提高巴豆利用率和價值提供了科學依據(jù)。