雷公藤甲素通過(guò)抑制NogoA/RhoA/ROCK信號(hào)通路減輕氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧所致的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

張慧宇白振軍李 亮張金鋒解佳偉鄧 亮孟 燕郭敏芳

(1.山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院,山西 大同 037009;2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西 大同 037009)

缺血性腦卒中占腦卒中的80%以上[1]。目前其主要的治療方法仍然是快速溶栓,但是在某些情況下存在缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷[2]。損傷神經(jīng)元周圍存在的抑制微環(huán)境是腦I/R損傷后神經(jīng)功能修復(fù)困難的主要原因之一。神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子A(neurite outgrowth inhibitor A, NogoA)是構(gòu)成這種抑制微環(huán)境的重要成分[3]。生理學(xué)上,NogoA信號(hào)通過(guò)其受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的發(fā)育成熟、髓鞘形成、調(diào)節(jié)樹(shù)突棘形態(tài)和突觸可塑性從而調(diào)節(jié)大腦的學(xué)習(xí)和記憶等方面具有重要作用[4]。NogoA可以結(jié)合Nogo受體(Nogo receptor, NgR),使其下游的RhoA/Rho激酶(ROCK)通路激活,從而抑制軸突再生以及脊髓或腦損傷后的功能恢復(fù)[5]。有研究顯示,NogoA與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),并且調(diào)節(jié)突觸的可塑性[6],在體內(nèi),阻斷NogoA可導(dǎo)致皮質(zhì)錐體神經(jīng)元的樹(shù)突棘密度增加,而抗NogoA抗體治療可以使由皮質(zhì)控制精確運(yùn)動(dòng)的學(xué)習(xí)得到了改善,表明NogoA是一種重要的突觸可塑性調(diào)節(jié)劑,也是運(yùn)動(dòng)皮層熟練動(dòng)作學(xué)習(xí)的調(diào)節(jié)器[7]。因此,消除腦I/R損傷后抑制神經(jīng)再生過(guò)程的障礙,NogoA/RhoA/ROCK通路的下調(diào)非常重要。

由于溶栓治療的時(shí)間窗窄,并且存在I/R損傷和費(fèi)用高等缺點(diǎn)。在各種卒中相關(guān)疾病的治療方法中,中草藥療法在古代醫(yī)學(xué)體系早有描述[8]。因此,眾多研究者致力于從中草藥中尋找有效的治療藥物。雷公藤甲素是從中草藥雷公藤中提取出來(lái)的活性成分,具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。研究表明雷公藤甲素可以減輕腦I/R損傷[10-11],然而,關(guān)于雷公藤甲素改善腦I/R損傷的機(jī)制還有待深入研究。因此,本實(shí)驗(yàn)選用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SHSY5Y),采用氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)誘導(dǎo)其損傷,觀察雷公藤甲素對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用,并且基于NogoA/RhoA/ROCK信號(hào)通路探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

SH-SY5Y人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所贈(zèng)送。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤甲素(≥98%,貨號(hào):DL0034)購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司;法舒地爾(批號(hào):2007171)由天津紅日藥業(yè)公司提供;胎牛血清(貨號(hào):16140063)、高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):21013024),無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):11966025)和青霉素-鏈霉素雙抗混合液(貨號(hào):5140163)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;NogoA抗體(貨號(hào):13401)、ROCK2抗體(貨號(hào):47012)、突觸后密度蛋白-95(synaptic protein postsynaptic density 95, PSD-95)抗體(貨號(hào):3450),Alex Flour?594和 Alex Flour?488標(biāo)記的IgG二抗(貨號(hào):8889、4412)均購(gòu)自美國(guó)CST公司;NgR抗體(ab184556)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;RhoA抗體(貨號(hào):A0272)、神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associatedprotein-43, Gap43)抗體(貨號(hào):A6376)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的IgG二抗(貨號(hào):AS014)均購(gòu)自ABclonal公司;CCK8試劑盒(貨號(hào):C0038)、JC-1試劑盒(貨號(hào):C2003S)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

FV-1000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司);HERAcell 150i三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);H1M酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰);SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)(美國(guó) Bio-Rad 公司);NanoDrop One超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK8法篩選TP濃度

用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SY5Y細(xì)胞,常規(guī)傳代。將傳代細(xì)胞(每毫升5×103個(gè))接種于96孔板中,于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入不同濃度的雷公藤甲素(0、0.1、1、10、50、100、500 nmol/L),每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,藥物處理24 h按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行CCK8檢測(cè),每孔加入20 μL CCK8溶液,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度值(OD值)。最后計(jì)算細(xì)胞活力,計(jì)算公式為(用藥孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。選取可以增加細(xì)胞活性的雷公藤甲素濃度為實(shí)驗(yàn)使用濃度。

1.3.2 OGD/R模型的建立及分組

將細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組、模型組、雷公藤甲素干預(yù)組(雷公藤甲素組)、Rho激酶抑制劑法舒地爾干預(yù)組(法舒地爾組)。模型組、雷公藤甲素組和法舒地爾組細(xì)胞進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo)損傷,細(xì)胞更換無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基,雷公藤甲素組和法舒地爾組在更換無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基后分別加入1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地爾,3組細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱(94% N2、5% CO2、1% O2、37℃)中培養(yǎng)4 h,然后模型組更換為完全培養(yǎng)基,雷公藤甲素組和法舒地爾組分別更換含有1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地爾的完全培養(yǎng)基。37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組細(xì)胞加完全培養(yǎng)基于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞活性的檢測(cè)

細(xì)胞復(fù)糖復(fù)氧24 h后按照上述CCK8檢測(cè)方法檢測(cè)4組細(xì)胞的活性。細(xì)胞活性計(jì)算公式為(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。評(píng)估雷公藤甲素對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。

1.3.4 線粒體膜電位的檢測(cè)

將細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi),復(fù)糖復(fù)氧24 h后每孔加入1 mL JC-1工作液,37℃恒溫孵育20 min后用JC-1染色緩沖液洗滌,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫熒光染色

復(fù)糖復(fù)氧24 h后,將接種于24孔板內(nèi)細(xì)胞爬片上的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定1 h,PBS洗滌后用含有0.3% Triton X-100和1%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉1 h,加入一抗NogoA、ROCK2、GAP43(1∶1000),4℃過(guò)夜后加入594或488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育2 h后用封片液封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)

復(fù)糖復(fù)氧24 h后,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì),使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白定量并將各組蛋白濃度調(diào)齊。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h,加入一抗GAPDH(1∶1000)或NogoA、NgR、RhoA、ROCK2、PSD-95、GAP43(1∶500),4℃過(guò)夜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000),室溫孵育2 h后TBST洗膜,最后用凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。組間差異采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素濃度篩選

CCK8結(jié)果顯示,當(dāng)雷公藤甲素濃度≤10 nmol/L時(shí),細(xì)胞受藥物影響小,細(xì)胞活力與對(duì)照孔相比差異無(wú)顯著性意義;當(dāng)雷公藤甲素濃度≥50 nmol/L時(shí),細(xì)胞活力下降,與對(duì)照孔相比差異有顯著性意義(P＜0.001),見(jiàn)表1?？梢?jiàn)雷公藤甲素濃度在≤10 nmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,而且雷公藤甲素濃度為0.1 nmol/L和1 nmol/L時(shí)可增加細(xì)胞活性,因此后續(xù)我們選擇雷公藤甲素濃度為1 nmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 不同雷公藤甲素濃度對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響(n=5)Table 1 Effects of triptolide of different concentrations on the viability of normal SH-SY5Y cells

2.2 雷公藤甲素對(duì)細(xì)胞活性的影響

CCK8結(jié)果顯示,模型組的細(xì)胞活性較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.001);與模型組相比,雷公藤甲素組和法舒地爾組細(xì)胞活性有顯著性提高(P＜0.001)。并且雷公藤甲素組和法舒地爾組相比,細(xì)胞活性無(wú)顯著差異,見(jiàn)表2。

表2 雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用(n=5)Table 2 Protective effect of triptolide on SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.3 雷公藤甲素對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降時(shí)JC-1產(chǎn)生綠色熒光;線粒體膜電位升高時(shí)JC-1產(chǎn)生紅色熒光。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞的紅/綠熒光強(qiáng)度比值明顯下降(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細(xì)胞的紅/綠熒光強(qiáng)度比值均顯著增加(P＜0.001);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比,紅/綠熒光強(qiáng)度比值無(wú)顯著差異見(jiàn)圖1。

圖1 雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的 SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體膜電位的影響Figure 1 Effect of triptolide on the mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.4 雷公藤甲素對(duì)突觸蛋白的影響

免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白GAP43和PSD-95的表達(dá)明顯下降(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細(xì)胞GAP43和PSD-95的表達(dá)均顯著升高(P＜0.05);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比無(wú)顯著差異,具體內(nèi)容詳見(jiàn)圖2。

圖2 雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞突觸蛋白的影響Figure 2 Effect of triptolide on the expression of synaptic protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.5 雷公藤甲素對(duì)NogoA/RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白的影響

免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表達(dá)均明顯增加(P＜0.001);與模型組比較,雷公藤甲素組和法舒地爾組細(xì)胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表達(dá)均下調(diào)(P＜0.001);雷公藤甲素組和法舒地爾組相比無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖3。

圖3 雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞NogoA/RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白的影響Figure 3 Effect of triptolide on the expression of NogoA/RhoA/ROCK signaling pathway protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

3 討論

多項(xiàng)研究表明,雷公藤甲素可以改善腦I/R損傷,其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)自噬、抗凋亡等有關(guān)[12-13]。因此雷公藤甲素可能成為腦卒中的潛在治療藥物。本實(shí)驗(yàn)在體外建立SH-SY5Y細(xì)胞的OGD/R損傷模型,作為腦I/R損傷的細(xì)胞模型,觀察了雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)效果。CCK8結(jié)果顯示OGD/R可以導(dǎo)致細(xì)胞活性降低,而雷公藤甲素干預(yù)增加了細(xì)胞活性,減輕了細(xì)胞損傷。JC-1染色顯示了同樣的結(jié)果,模型組細(xì)胞的線粒體膜電位下降,雷公藤甲素干預(yù)可以使線粒體膜電位升高。表明雷公藤甲素對(duì) OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)。

GAP43是軸突生長(zhǎng)錐的主要蛋白,被認(rèn)為是軸突可塑性的內(nèi)在決定因素,是軸突再生的主要標(biāo)志物,參與神經(jīng)元的分化、可塑性和再生[14]。GAP43表達(dá)增加可能是腦缺血后功能恢復(fù)的機(jī)制之一[15]。PSD-95是維持興奮性神經(jīng)元突觸后密度區(qū)建立的關(guān)鍵,與神經(jīng)元功能和存活密切相關(guān),PSD-95蛋白可以通過(guò)對(duì)抗興奮性毒性為腦卒中提供神經(jīng)保護(hù)作用,PSD-95水平增加可以促進(jìn)突觸可塑性[16]。免疫熒光和Western blot結(jié)果均顯示,OGD/R損傷的 SH-SY5Y 細(xì)胞中GAP43和PSD-95的表達(dá)均減少,表明OGD/R在誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的同時(shí)減弱了神經(jīng)元突觸功能。而雷公藤甲素干預(yù)不僅可以減輕OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,還可以使GAP43和PSD-95表達(dá)增加,促進(jìn)突觸可塑性。

腦I/R損傷的病理生理過(guò)程極為復(fù)雜。而成人腦組織缺血缺氧后通過(guò)軸突再生或者代償性纖維生長(zhǎng)來(lái)自我修復(fù)是極為有限且不完全的,原因有多方面,包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的減少、抑制性蛋白的產(chǎn)生、膠質(zhì)瘢痕的形成等等,會(huì)形成抑制性微環(huán)境,從而限制受損神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)可塑性[17]。其中NogoA作為軸突再生的主要障礙受到了廣泛關(guān)注。NogoA通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)RhoA/ROCK通路,抑制軸突生長(zhǎng),阻礙神經(jīng)再生和修復(fù)[18]。有研究顯示,在全腦缺血大鼠中,NogoA的表達(dá)在6 h顯著增加,持續(xù)7 d[19]。Eslamboli等[20]報(bào)告絨猴腦缺血后2個(gè)月內(nèi)NogoA水平持續(xù)升高。并且在腦I/R損傷的動(dòng)物模型腦組織中NogoA也表現(xiàn)為升高狀態(tài)[21-22]。因此。NogoA參與缺血性腦卒中的病理過(guò)程。而抗NogoA免疫療法可改善中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生和神經(jīng)可塑性,并改善腦卒中動(dòng)物模型的預(yù)后[23]。還有研究顯示,腦I/R損傷大鼠腦組織中RhoA和ROCK基因和蛋白表達(dá)水平均顯著升高[24],而ROCK抑制劑法舒地爾可以刺激腦I/R損傷大鼠軸突再生并增加腦血流量[25]。這些結(jié)果均表明,抑制NogoA/RhoA/ROCK通路可能有助于I/R腦損傷的恢復(fù)。雖然有研究表明雷公藤甲素可以改善腦I/R損傷,但是其機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表達(dá)均增加,與模型組相比,雷公藤甲素干預(yù)組細(xì)胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表達(dá)均減少。我們同時(shí)采用了ROCK抑制劑法舒地爾對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。觀察到雷公藤甲素對(duì)OGD/R損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用與法舒地爾相當(dāng),法舒地爾干預(yù)同樣能使細(xì)胞活性和線粒體膜電位增加,并且使GAP43和PSD-95的表達(dá)增加,NogoA、NgR、RhoA和ROCK2的表達(dá)下調(diào),并且和雷公藤甲素干預(yù)組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義。這些結(jié)果均表明雷公藤甲素可能通過(guò)抑制NogoA/RhoA/ROCK通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述,雷公藤甲素可能通過(guò)抑制神經(jīng)元內(nèi)NogoA/RhoA/ROCK通路的激活改善OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,并且促進(jìn)突觸可塑性。此研究為深入探討雷公藤甲素對(duì)腦I/R損傷的保護(hù)作用以及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。