靛藍(lán)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的抗炎作用

賴家文，林麗云，王東翔，林鈺，黎倩，楊麗紅，陳健勤，劉靖

炎癥是機(jī)體遭受各種內(nèi)外刺激后的一種防御性反應(yīng)，巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，同時(shí)也是產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞?，F(xiàn)代研究[1]表明，巨噬細(xì)胞在炎癥性疾病的發(fā)生和炎癥維持中具有關(guān)鍵作用。因此從抗炎的角度研究和開發(fā)具有巨噬細(xì)胞保護(hù)作用的藥物對(duì)炎癥性疾病的治療具有重要意義。

中藥板藍(lán)根、大青葉、青黛都具有清熱解毒、涼血等功效[2-4]，現(xiàn)代研究早已證實(shí)以上3種中藥均具有良好的抗炎作用，中藥單體靛藍(lán)(indigo, IDG)是他們的共同主要有效活性成分之一[5-6]。近些年研究[7]發(fā)現(xiàn)，靛藍(lán)具有抗炎和抗腫瘤作用，但目前對(duì)于其治療臨床炎癥性疾病的研究相當(dāng)罕見，靛藍(lán)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響更是未見報(bào)道?；诖?，本研究采用LPS建立THP-1細(xì)胞炎癥模型，觀察靛藍(lán)對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，以期從細(xì)胞水平發(fā)掘靛藍(lán)的抗炎作用，為靛藍(lán)治療炎癥性疾病的開發(fā)和臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人巨噬細(xì)胞系(THP-1來(lái)源)，購(gòu)自于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2藥物及主要試劑 靛藍(lán)(Indigo，IDG，純度100%)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈雙抗、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MTT試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司； ELISA試劑盒包括：人IL-23p19 (Cat # 88-7237-86)、人IL-6(Cat # 88-7066-22)、人IL-8(Cat # 88-8086-22)、人TNF-α (Cat # 88-7346-88)、IL-1β (Catalog # 88-7261-88)及Prestained Protein Ladder均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司：Trizol Reagent、M-MLV試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ MasterMix均購(gòu)自日本TaKaRa公司；本實(shí)驗(yàn)中所用的一抗：兔抗人Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-AP)均購(gòu)自于Proteintech公司(武漢，中國(guó))。二抗：山羊抗兔(#32460)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3主要儀器 HealForce HF90 型二氧化碳培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))、ABI 7500 型熒光定量PCR儀器(美國(guó)Applied Biosystems 公司)、酶標(biāo)儀(德國(guó)Eppendorf公司)、C-Digit化學(xué)發(fā)光掃描儀(美國(guó)LI-COR公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) THP-1使用RPMI-1640(含10%胎牛血清，青、鏈霉素，谷氨酰胺及非營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸)培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代操作。

1.5THP-1炎癥損傷模型制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞按2×106個(gè)/孔培養(yǎng)于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為20 ng/mL LPS刺激24 h制備THP-1細(xì)胞炎癥損傷模型。

1.6RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 每個(gè)培養(yǎng)孔加入250 μL Trizol Reagent，按說(shuō)明書提取RNA，以Nanodrop 2000超微量紫外/可見光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)測(cè)定RNA濃度；按M-MLV說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Master Mix配制20 μL定量PCR反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)使用模板cDNA 0.5 μg。使用ABI 7500 型熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增及定量檢測(cè)；擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)周期。以融解曲線判斷是否存在非特異擴(kuò)增。每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)重復(fù)孔，檢測(cè)結(jié)果取均值。引物序列見表1。

表1 定量PCR引物序列表Tab.1 Real-time PCR primer sequences.

1.7酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 不同濃度的靛藍(lán)干預(yù)1 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)其中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α細(xì)胞因子的含量，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 收集THP-1細(xì)胞，按RIPA裂解液說(shuō)明書得到總蛋白，BCA法定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將條帶電轉(zhuǎn)至0.2 μm PVDF膜上。5%牛血清白蛋白室溫封閉3 h，加入適當(dāng)濃度的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再置于1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，美國(guó)LI-COR公司的C-Digit化學(xué)發(fā)光掃描儀進(jìn)行掃描拍照。照片通過(guò)使用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。計(jì)算時(shí)采用各指標(biāo)與β-actin的光密度比值的相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用 SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料進(jìn)行K-S(Kolmogorov-Smirnor)檢驗(yàn)，是否符合正態(tài)分布，以P>0.05認(rèn)為符合正態(tài)分布。對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，其中符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；對(duì)于方差不齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較使用Tamhance′sT2檢驗(yàn)；對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的“Indepen-dent-SamplesKruskal-WallisText”。檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graphpad prism 8.0作圖。

2 結(jié)果

2.1靛藍(lán)對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，LPS刺激24 h后，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α mRNA的表達(dá)均顯著增高(P<0.05)。0.4 μmol/L和4 μmol/L濃度的靛藍(lán)干預(yù)后均可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；40 μmol/L濃度的靛藍(lán)亦可顯著抑制IL-6、IL-23p19、TNF-α的轉(zhuǎn)錄(P<0.01)，對(duì)IL-1β和IL-8的抑制作用雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較LPS組相比，仍表現(xiàn)出抑制作用。結(jié)果表明，靛藍(lán)可通過(guò)下調(diào)相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，阻斷LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)THP-1細(xì)胞的保護(hù)作用，其中0.4 μmol/L和4 μmol/L這兩個(gè)濃度作用效果更明顯，見圖1。

Note: Compared with blank group#P<0.05, ##P<0.01, ####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1.圖1 靛藍(lán)對(duì)各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of indigo on mRNA expression of cytokines

2.2靛藍(lán)對(duì)LPS刺激的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥細(xì)胞因子含量的影響 經(jīng)LPS刺激后，培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19、TNF-α這4種炎癥細(xì)胞因子的含量均顯著升高(P<0.001)。4 μmol/L的靛藍(lán)對(duì)上述炎癥因子的表達(dá)均有顯著抑制作用(P<0.05)，而0.4 μmol/L和40 μmol/L濃度的靛藍(lán)亦可顯著抑制IL-1β、IL-8、IL-23和TNF-α的表達(dá)(P<0.05)，但它們下調(diào)IL-6的表達(dá)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明不同濃度的靛藍(lán)均可發(fā)揮一定的抗炎作用，其中4 μmol/L濃度的靛藍(lán)作用效果最明顯，見圖2。

Note: Compared with blank group###P<0.001,####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.00 1,****P<0.000 1.圖2 靛藍(lán)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中各炎癥因子表達(dá)含量的影響Fig.2 Effects of indigo on the expression of inflammatory factors

2.3靛藍(lán)對(duì)Nrf2/HO-1細(xì)胞信號(hào)通路的影響 LPS可顯著抑制Nrf2、HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而靛藍(lán)處理后可增加Nrf2、HO-1信號(hào)通路的表達(dá)(P<0.05)；提示靛藍(lán)可能通過(guò)刺激Nrf2/HO-1信號(hào)通路，參與抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)，見圖3。

Note: Compared with blank group #P<0.05, ##P<0.01, ####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1.圖3 靛藍(lán)對(duì)THP-1細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)含量的影響Fig.3 Effects of indigo on the content of Nrf2 and HO-1 proteins

3 討論

近年來(lái)，很多常用中藥及其有效活性成分都被證實(shí)可從免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等不同方面發(fā)揮治療作用，從植物中發(fā)掘新型抗炎藥物，研究其抗炎作用并探討其機(jī)制，是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一。靛藍(lán)是常用清熱解毒中藥板藍(lán)根、大青葉、青黛的共同有效活性成分，雖有初步研究表明靛藍(lán)具有抗炎作用，但大部分僅停留在網(wǎng)絡(luò)藥理、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等層面，在細(xì)胞層面研究較少，具體機(jī)制仍不清楚。

THP-1 細(xì)胞可經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化為成熟的巨噬細(xì)胞，常用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)的機(jī)制研究中[8]。LPS是一種來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的特異性抗原復(fù)合物，是免疫系統(tǒng)最有效的激活劑之一[9]。LPS能與巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)結(jié)合，激活相關(guān)炎癥信號(hào)通路，促使IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-23等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，引起機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)和炎癥損傷，是建立THP-1細(xì)胞炎癥模型公認(rèn)的造模方法之一[10]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激THP-1細(xì)胞24 h以模擬THP-1巨噬細(xì)胞炎癥模型，通過(guò)ELISA及qRT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用20 ng/mL濃度的LPS刺激24 h后，THP-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α的表達(dá)均有不同程度的升高，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的炎癥模型構(gòu)建成功。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靛藍(lán)干預(yù)后，可以顯著抑制IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α的表達(dá)，且在低濃度時(shí)就具有較好的抑制作用，說(shuō)明靛藍(lán)具有良好的抗炎效果，是治療炎癥性疾病的潛力藥物。

炎癥損傷可引起細(xì)胞活性氧升高，而過(guò)量的ROS可誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞向輔助性T(helper T cell，Th)17細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而分泌大量炎癥因子如IL-17、IL-22、TNF-α等，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[11-12]。多種炎癥性疾病使用抗氧化劑藥物治療后可取得較好的療效[13-14]。Nrf2/HO-1信號(hào)通路是防御氧化應(yīng)激的重要通路之一，在生理?xiàng)l件下，Nrf2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；刺激后，Nrf2將迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并且通過(guò)激活靶基因啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件進(jìn)一步激活HO-1的表達(dá)，以防止細(xì)胞氧化損傷，從而緩解損傷及炎癥反應(yīng)[15]。在某些炎癥性疾病如銀屑病、特應(yīng)性皮炎、炎癥性腸病等的發(fā)病機(jī)制中，已證實(shí)某些促炎細(xì)胞因子如IL-17、IL-1β和TNF-α等可產(chǎn)生過(guò)量的活性氧代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致相關(guān)免疫細(xì)胞激活，進(jìn)一步刺激炎癥的發(fā)展[16]。本實(shí)驗(yàn)表明靛藍(lán)可誘導(dǎo)Nrf2、HO-1的表達(dá)，說(shuō)明靛藍(lán)可以激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮抗炎作用；但其是否確實(shí)清除了細(xì)胞中的ROS，以及其抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)與其抗氧化作用之間的關(guān)系，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

巨噬細(xì)胞對(duì)調(diào)控皮膚微環(huán)境變化和宿主炎癥反應(yīng)的過(guò)程至關(guān)重要。本研究從治療銀屑病的常用中藥板藍(lán)根、大青葉、青黛的共同有效成分靛藍(lán)入手，探索中藥單體靛藍(lán)對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)靛藍(lán)在LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥模型上的治療效果，同時(shí)首次證明靛藍(lán)可下調(diào)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，提示靛藍(lán)可能是抗炎的潛力藥物，同時(shí)也為青黛、大青葉、板藍(lán)根等中藥治療銀屑病提供新的科學(xué)依據(jù)。