茶樹(shù)茉莉酸合成與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因在烏龍茶加工過(guò)程中對(duì)萜類物質(zhì)的影響

盧麗，詹冬梅，周承哲,3，朱晨,3，謝思藝，徐凱，田采云，賴鐘雄，郭玉瓊*

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)茶產(chǎn)業(yè)研究院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002

茉莉酸類物質(zhì)（Jasmonates，JAs）是重要的植物激素，在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中具有重要作用[1-5]。當(dāng)植物遭受到損傷時(shí)，植物體內(nèi)的茉莉酸水平升高，激活植物防御相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而提高植物逆境脅迫的防御能力[6-7]。茉莉酸合成途徑包括十六烷途徑和十八烷途徑[8-9]。其中，十八烷途徑始于亞麻酸（α-1inolenic acid，α-LA）被脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）氧化成13-氫過(guò)氧化亞麻酸（13-hydroperoxylinolenic acid，13-HPOT），再經(jīng)丙二烯氧化合酶（Allene oxide synthase，AOS）及丙二烯環(huán)化酶（Allene oxide cyclase，AOC）氧化生成12-氧-二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid，12-OPDA），經(jīng)12-氧-二烯酸還原酶（12-oxophytodienoic acid reductase，OPR）作用，再經(jīng)3次β-氧化后形成茉莉酸；茉莉酸通過(guò)茉莉酸-氨基合成酶（Jasmonic acid-amino synthetase，JAR）作用生成茉莉酸-異亮氨酸（Jasmonic Acid-Isoleucine，JA-Ile）[10-11]。茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，靜息階段植物體內(nèi)有少量JA-Ile，茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白（Jasmonate ZIM-domain，JAZ）招募輔抑制因子（Topless，TPL）和NOVEL INTERACTOR（NINJA）共同形成三元復(fù)合物抑制轉(zhuǎn)錄因子（Myelocytomatosis2，MYC2）靶基因的表達(dá)，到轉(zhuǎn)運(yùn)階段體內(nèi)JA-Ile含量劇增，JA-Ile促進(jìn)泛素連接酶復(fù)合體SCFCOI1與JAZ結(jié)合，使JAZ在26 S蛋白酶體的作用下降解，共激活因子（Mediator Subunit 25，MED25）和MYC2相互作用增強(qiáng)，進(jìn)入激活階段，該過(guò)程中LEUNIG/LEUNIG HOMOLOG（LUG/LUH）能夠促進(jìn)MED25和HAC1相互作用以及MED25和MYC2相互作用，最后激活MYC2靶基因表達(dá)，即茉莉酸應(yīng)答基因表達(dá)[12-14]。

烏龍茶是我國(guó)六大茶類之一，具有馥郁的天然花果香[15]。萎凋和做青是烏龍茶加工的關(guān)鍵工序，對(duì)烏龍茶獨(dú)特風(fēng)味的形成具有關(guān)鍵作用。在萎凋及做青過(guò)程中，茶葉會(huì)遭受紫外線輻射、機(jī)械損傷和失水等多種非生物脅迫。這些非生物脅迫可誘導(dǎo)茉莉酸積累，從而激活防御基因的表達(dá)，同時(shí)茉莉酸的積累對(duì)香氣形成具有重要作用[16-17]。研究表明，日光萎凋可誘導(dǎo)茉莉酸含量增加，促進(jìn)萜類合成基因表達(dá)及萜類化合物積累[18]。做青過(guò)程中的連續(xù)損傷誘導(dǎo)茉莉酸生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使茉莉酸含量維持較高水平[19-20]，有助于激活香氣形成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[16]。林馨穎等[21]對(duì)茶樹(shù)LOX基因家族進(jìn)行鑒定及分析，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)LOX基因家族部分基因在白茶萎凋過(guò)程中的某些時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)香氣物質(zhì)形成；胡清財(cái)?shù)萚22]對(duì)茶樹(shù)COI1基因家族進(jìn)行鑒定，其中，CsCOI1a在烏龍茶室內(nèi)萎凋后表達(dá)量顯著上調(diào)，CsCOI1b在日光萎凋后表達(dá)量顯著上調(diào)，同時(shí)茉莉酸含量發(fā)生顯著變化。反式-橙花叔醇、α-法尼烯和芳樟醇等萜類化合物是烏龍茶中檢測(cè)到的主要香氣組分，具有特殊的天然花果香和獨(dú)特的韻味，香氣閾值低，在做青過(guò)程的機(jī)械損傷脅迫下大量形成[23-25]。而茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因在烏龍茶加工過(guò)程中對(duì)萜類物質(zhì)形成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉和殺青前青葉進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)，利用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)測(cè)定萜類化合物相對(duì)含量，并引入香氣特性影響值（Aroma character impact，ACI）評(píng)估單個(gè)萜類化合物對(duì)烏龍茶香型的貢獻(xiàn)程度。同時(shí)，對(duì)鐵觀音鮮葉中茶樹(shù)茉莉酸合成途徑基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，分析茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)量和茉莉酸含量及萜類物質(zhì)相對(duì)含量之間的相關(guān)性，以期了解茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因與烏龍茶加工過(guò)程香氣形成機(jī)制，為基因應(yīng)答脅迫的研究提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)于2021年5月在福建省安溪?jiǎng)⒔瘕埐铇I(yè)有限公司生產(chǎn)基地進(jìn)行。以鐵觀音茶樹(shù)品種一芽二、三葉為原料，采用閩南傳統(tǒng)鐵觀音加工工藝。主要工序包括鮮葉、萎凋、做青（一搖、二搖、三搖、四搖、殺青前攤放，做青房溫度23 ℃、相對(duì)濕度75%～85%）、炒青、揉捻、初培、復(fù)培、復(fù)包揉、文火慢烤、揀簸。按四分法取鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉進(jìn)行液氮固樣，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)，每次取樣進(jìn)行 3次生物學(xué)重復(fù)，樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 儀器與試劑

主要儀器：SPME固相微萃取裝置，美國(guó)Agilent公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀，美國(guó)羅氏公司；多功能酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。

主要試劑：RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海翌圣生物科技有限公司；Trans Zol UP試劑盒、Easy Script First-Strand c DNA Synthesis Super Mix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)鍵基因鑒定與組織特異性分析

從茶樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tpia.teaplant.org）中下載茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因相關(guān)數(shù)據(jù)，使用擬南芥序列作為查詢序列，并結(jié)合其京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）注釋獲取茶樹(shù)參與茉莉酸合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)候選基因序列，再根據(jù)CDD網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)獲取的候選基因進(jìn)行驗(yàn)證。

從TPIA下載該途徑基因在不同器官（芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、果實(shí)、莖、根）特異性表達(dá)譜，以 log2（FPKM+0.1）轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)并利用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖。依據(jù)FPKM＜0.3、FPKM＞1、FPKM＞60分別對(duì)應(yīng)基因表達(dá)較低或不表達(dá)、有表達(dá)、高表達(dá)，篩選出茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因家族在芽和嫩葉中FPKM＞1或FPKM＞60的基因。

1.2.2 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

采用TBtools軟件提取茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp序列作為啟動(dòng)子區(qū)域；提交至 Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugen-t.be/webtools/plantcare/html）網(wǎng)站預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式作用元件。篩選出茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因家族中含有茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、損傷響應(yīng)元件（WUN-motif）和厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）數(shù)量較多的基因進(jìn)行熱圖可視化分析。

1.2.3 總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)

使用Trans Zol UP試劑盒分別提取鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉的總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，使用紫外分光光度計(jì)檢查純度和濃度。采用Easy Script First-Strand c DNA Synthesis Super Mix試劑盒將OD260/OD280值在1.9～2.1的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR檢測(cè)分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用法計(jì)算基因的表達(dá)水平[26]，設(shè)置 3次重復(fù)，qRT-PCR擴(kuò)增的特異性引物信息如表2所示。

1.2.4 茉莉酸含量測(cè)定

樣品溶液的制備：將鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉、殺青前青葉分別放入預(yù)冷的研缽中，按1 g樣品加入9 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）比例加入PBS，添加少量石英砂，冰浴研磨，勻漿液置于離心管，4 ℃，1 000 g離心20 min，取上清液待測(cè)。

茉莉酸含量的測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA，Enzyme-linked immuno sorbent assay）測(cè)定茉莉酸含量。室溫平衡20 min后取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔和空白對(duì)照孔，按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行，待反應(yīng)完成后加入50 μL終止液，在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。將樣品吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為茉莉酸的實(shí)際濃度。

1.2.5 茶樹(shù)茉莉酸合成途徑基因功能驗(yàn)證

基于Liu等[27]的方法稍作修改，使用Soligo（https://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl）設(shè)計(jì)與CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1互補(bǔ)的反義寡核苷酸（AsODN）序列，以有義寡核苷酸（sODN）序列作為對(duì)照。先用葡萄糖水（80 μmol·L-1）將AsODN 和sODN序列稀釋至100 μmol·L-1，再稀釋5倍后備用。采摘鐵觀音茶樹(shù)嫩梢，保留一芽二葉，將其末端放入含有稀釋引物的1.5 mL微型離心管中，膠片密封，放置于光照培養(yǎng)箱（溫度24 ℃，濕度(75±5)%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗）培養(yǎng)24 h后取出，液氮固樣，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。取第二片鮮葉參照1.2.3章節(jié)的方法進(jìn)行總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)，參照1.2.4章節(jié)的方法進(jìn)行茉莉酸含量測(cè)定。

1.2.6 萜類化合物測(cè)定

取烏龍茶加工過(guò)程鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉，進(jìn)行真空冷凍干燥，置于干燥皿36 h，使用研磨機(jī)研磨成均質(zhì)粉末，對(duì)應(yīng)茶粉含水率分別為5.718%、5.563%、5.616%、5.569%和5.711%。參考Zhou等[28]方法，利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)烏龍茶加工過(guò)程中揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè)。

HS-SPME萃取方法：稱取1.000 g樣品于頂空瓶中，加入1 mL飽和NaCl溶液，采用HS-SPME進(jìn)行樣本萃取。萃取條件：在100 ℃恒溫下，振蕩 5 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（使用前萃取頭在 Fiber Conditioning Station中250 ℃下老化5 min）插入樣品頂空瓶萃取15 min，于250 ℃下解析5 min。

GC分析：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣N2≥99.999%，流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，溶劑延遲3.5 min。升溫程序：40 ℃保持3.5 min，然后以10 ℃·min-1升至100 ℃，再以7 ℃·min-1升至180 ℃，最后以25 ℃·min-1升至280 ℃保持7 min。分流模式為不分流進(jìn)樣。

MS分析：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)譜接口280 ℃，掃描方式為選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM），定性定量離子精準(zhǔn)掃描（GB 23200.8—2016）。

1.2.7 定性定量分析

基于MWGCSIM1.0數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)[29]，用MassHunter定量軟件打開(kāi)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分及校正，實(shí)現(xiàn)樣本代謝物質(zhì)譜定性及相對(duì)定量分析。萜類物質(zhì)相對(duì)含量計(jì)算公式如下：

式中，R表示相對(duì)含量，μg·kg-1；S1和S2分別表示目標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積；m1表示樣本質(zhì)量，kg；m2表示內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，μg。

1.2.8 ACI的計(jì)算方式

查閱文獻(xiàn)[30-31]及相關(guān)網(wǎng)站確定揮發(fā)性萜類物質(zhì)的閾值，并進(jìn)行ACI值計(jì)算，公式如下：

式中，Pi表示第i個(gè)揮發(fā)物的峰面積百分比；Ti表示第 i個(gè)揮發(fā)物在空氣中的閾值；k為揮發(fā)物總數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示；采用SPSS 25進(jìn)行相關(guān)性分析，GraphPad Prism v6.01繪制柱狀圖，利用TBtools v1.046進(jìn)行熱圖繪制和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因分析

從茶樹(shù)基因組中共找到11個(gè)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因家族，包含133個(gè)候選基因，按其在染色體上的排列順序命名，以log2（FPKM+0.1）轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)繪制表達(dá)熱圖，其中72個(gè)基因?qū)儆谲岳蛩岷铣赏緩?，包?8個(gè)LOX基因、3個(gè)AOS基因、5個(gè)AOC基因、7個(gè)OPR基因、15個(gè)ACX基因、12個(gè)MFP2基因和12個(gè)JAR基因（圖1A）；61個(gè)基因?qū)儆谲岳蛩嵝盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括17個(gè) COI1基因、7個(gè)JAZ基因、22個(gè)MYC2基因、11個(gè)TPL基因和4個(gè)LUG基因（圖1B）。

圖1 茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因不同器官表達(dá)譜Fig.1 Different organ expression profiles of key genes of jasmonic acid synthesis and signal transduction pathway in tea plants

為探究茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因在烏龍茶加工過(guò)程中表達(dá)模式，依據(jù)FPKM值以及順式作用原件預(yù)測(cè)結(jié)果，在芽和嫩葉中篩選到19個(gè)FPKM值較高且含有茉莉酸響應(yīng)元件或脅迫響應(yīng)元件較多的基因，包括CsLOX11（CSS0032783.1）、CsLOX12（CSS0033612.1）、CsAOS2（CSS0037941.1）、CsAOC1（CSS0006857.1）、CsOPR2（CSS0008148.1）、CsACX4（CSS0006548.1）、CsACX8（CSS0023687.1）、CsMFP2_6（CSS0020016.1）、CsJAR9（CSS0048352.1）、CsJAR12（CSS0026777.1）、CsCOI1_4（CSS0007560.1）、CsCOI1_12（CSS0022348.1）、CsJAZ4（CSS0022053.1）、CsJAZ7（CSS0031905.1）、CsTPL6（CSS0028710.1）、CsLUG4（CSS0049393.1）、CsMYC2_4（CSS0004820.1）、CsMYC2_15（CSS0037963.1）和CsMYC2_21（CSS0047466.1）。

2.2 基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析

為探究茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的潛在功能，對(duì)該途徑19個(gè)基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖2），19個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域共具有19種順式作用元件，包括10個(gè)植物激素響應(yīng)元件，其中茉莉酸響應(yīng)元件最多，為CGTCA-motif和TGACG-motif；5個(gè)脅迫響應(yīng)元件，損傷響應(yīng)元件（WUN-motif）和厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）較多；3個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件；1個(gè)次生代謝響應(yīng)元件。

2.3 茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量及茉莉酸含量分析

為探究茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因響應(yīng)烏龍茶加工過(guò)程逆境脅迫及表達(dá)模式，采用qRT-PCR檢測(cè)該途徑19個(gè)關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量。以采摘后鮮葉為對(duì)照，對(duì)該途徑19個(gè)關(guān)鍵基因經(jīng)過(guò)萎凋、二搖、四搖、殺青前攤放4個(gè)過(guò)程后的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖3B）。結(jié)果表明，CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2、CsACX8、CsMFP2_6、CsJAR9、CsJAR12、CsCOI1_4、CsJAZ7、CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等14個(gè)基因表達(dá)量均呈現(xiàn)二搖后升高、四搖后下降，殺青前回升的趨勢(shì)；CsCOI1_12、CsLUG4表達(dá)水平呈波動(dòng)上升趨勢(shì)；CsACX4和CsJAZ4的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在二搖后達(dá)到最高；CsTPL6表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)。

烏龍茶加工過(guò)程茉莉酸含量分析表明（圖3C），鮮葉經(jīng)過(guò)萎凋后茉莉酸含量顯著增加，搖青過(guò)程中茉莉酸含量保持較高水平，第四次搖青后茉莉酸含量達(dá)到最高水平，殺青前的攤放使茉莉酸含量回落，但仍高于鮮葉中的茉莉酸含量。

圖3 茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平和茉莉酸含量Fig.3 Expression levels of key genes in jasmonate synthesis and signal transduction pathway and jasmonate content in tea plants

2.4 茶樹(shù)茉莉酸合成途徑基因的功能分析

LOXs、AOS和AOC等是茉莉酸生物合成途徑中的重要酶基因，在茉莉酸類化合物生物合成途徑中起著重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證茶樹(shù)茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因?qū)岳蛩岷铣傻挠绊?，使用AsODN抑制茶樹(shù)茉莉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶LOX、AOS和AOC基因在鐵觀音鮮葉中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，用AsODN處理的鮮葉中CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照sODN處理的茶葉，茉莉酸含量趨勢(shì)與 CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1表達(dá)趨勢(shì)一致（圖4）。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證烏龍茶萎凋和做青過(guò)程的連續(xù)損傷誘導(dǎo)了茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)茉莉酸積累。

圖4 茶樹(shù)茉莉酸合成途徑基因的功能驗(yàn)證Fig.4 Functional verification of jasmonic acid synthetic genes in tea plants

2.5 烏龍茶加工過(guò)程萜類物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化

為了解烏龍茶加工過(guò)程萜類化合物的動(dòng)態(tài)變化，利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)烏龍茶加工過(guò)程中揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)鑒定篩選得到的萜類化合物進(jìn)行分析。結(jié)果共鑒定出73種萜類化合物（表3），大多數(shù)萜類化合物的相對(duì)含量在鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉和殺青前青葉5個(gè)樣品中存在顯著性差異，且多為花果香型物質(zhì)。

表3 烏龍茶加工過(guò)程萜類化合物相對(duì)含量Table 3 Relative terpene contents during oolong tea processing

續(xù)表3-1

續(xù)表3-2

為更直觀地了解萜類化合物在烏龍茶加工過(guò)程中的變化情況，采用TBtools V1.046軟件對(duì)萜類化合物進(jìn)行聚類熱圖分析（圖5），熱圖橫坐標(biāo)代表萜類化合物，縱坐標(biāo)代表不同加工過(guò)程茶樣，藍(lán)色表示萜類化合物含量比平均值低，紅色表示萜類化合物含量比平均值高，由圖5可知，萜類物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化分為兩類，第一類包括反式-橙花叔醇、α-法尼烯和芳樟醇等47種萜類化合物，其含量隨加工過(guò)程的進(jìn)行逐漸增加，主要在四搖以及殺青前攤放過(guò)程中含量最高；有研究表明，烏龍茶做青過(guò)程中α-法尼烯、橙花叔醇、反式-橙花叔醇和β-紫羅蘭酮等花果香型化合物增加，有利于烏龍茶特征香氣形成[32-35]。第二類包括月桂烯、香葉醇、檸檬醛等萜類化合物，其含量在鮮葉和萎凋葉中較高，在做青過(guò)程中逐漸減少。

圖5 烏龍茶加工過(guò)程萜類物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of terpenoids during oolong tea processing

香氣化合物香氣貢獻(xiàn)程度與其含量的高低并不完全一致，還與其閾值密切相關(guān)[36-37]。對(duì)73種萜類化合物閾值進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)[38-40]及網(wǎng)站查閱，得到19種萜類物質(zhì)閾值，并進(jìn)行ACI值計(jì)算，結(jié)果如表4所示。其中，芳樟醇（花香、柑橘香）、香葉醇（花果香）、β-紫羅蘭酮（花果香）和檸檬醛（檸檬香）閾值低，ACI值高，說(shuō)明這些物質(zhì)對(duì)烏龍茶香氣貢獻(xiàn)度高。

表4 烏龍茶萜類化合物ACI值Table 4 ACI values of terpenoids in oolong tea

2.6 基因表達(dá)量、茉莉酸含量和萜類物質(zhì)相對(duì)含量相關(guān)性分析

為探究茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因調(diào)控烏龍茶加工過(guò)程萜類物質(zhì)形成機(jī)制，對(duì)該途徑基因表達(dá)量、茉莉酸含量和萜類物質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析（圖6）。結(jié)果表明，基因表達(dá)量與茉莉酸含量之間，CsACX4、CsMFP2_6、CsCOI1_4、CsCOI1_12、CsTPL6、CsJAZ4和CsLUG4等7個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與茉莉酸含量存在正相關(guān)。茉莉酸含量與萜類物質(zhì)相對(duì)含量之間，茉莉酸含量與反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫羅蘭酮等44個(gè)萜類物質(zhì)的相對(duì)含量呈正相關(guān)，而與香葉醇呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與檸檬醛呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）?；虮磉_(dá)量與萜類化合物相對(duì)含量之間，CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等9個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯等萜類物質(zhì)相對(duì)含量呈正相關(guān)；CsOPR2、CsTPL6、CsLUG4和CsCOI1-12等基因的相對(duì)表達(dá)量與反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫羅蘭酮等萜類物質(zhì)的相對(duì)含量呈正相關(guān)；CsAOC1與檸檬醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛呈顯著正相關(guān)，CsOPR2與鄰傘花烴呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），CsCOI1-12與δ-欖香烯、(R)-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），CsTPL6與α-法尼烯、反式-橙花叔醇、紫羅蘭酮等35種萜類化合物呈極顯著正相關(guān)，與(+)-(E)-檸檬烯氧化物、茴香腦呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

圖6 基因表達(dá)量、茉莉酸含量和萜類物質(zhì)相對(duì)含量相關(guān)系數(shù)熱圖Fig.6 Heat map of correlation coefficient of gene expression,jasmonic acid content and relative content of terpenes

3 討論與結(jié)論

3.1 茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因響應(yīng)烏龍茶加工過(guò)程中多種脅迫

茉莉酸是一類重要的廣譜應(yīng)激激素，在響應(yīng)外界各類脅迫中發(fā)揮著重要作用[41]。本研究在茶樹(shù)基因組中共分析得到133個(gè)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑候選基因，并對(duì)芽和嫩葉上FPKM值表達(dá)較高且含有茉莉酸響應(yīng)元件或脅迫響應(yīng)元件較多的19個(gè)基因進(jìn)行分析。順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該途徑19個(gè)基因含有大量激素和脅迫響應(yīng)元件，包括茉莉酸響應(yīng)、損傷響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)等元件。研究表明，植物受到干旱、低溫、機(jī)械損傷等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致茉莉酸和JA-Ile的積累，從而激活防御基因的表達(dá)[42-43]。因此，本研究對(duì)茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因在烏龍茶加工過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該途徑基因響應(yīng)烏龍茶加工過(guò)程中的多種脅迫且表達(dá)模式不同，茉莉酸含量在此過(guò)程中大量積累。CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2、CsACX8、CsMFP2_6、CsJAR9、CsJAR12、CsCOI1_4、CsJAZ7、CsLUG4、CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等15個(gè)關(guān)鍵基因在萎凋、二搖、四搖和殺青前攤放4個(gè)過(guò)程表達(dá)模式呈N字型，且多數(shù)基因在二搖后達(dá)到最高水平。第四次搖青后基因顯著下調(diào)，可能與葉片經(jīng)過(guò)幾次搖青損傷失水后造成RNA降解，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄豐度降低有關(guān)。其中，LOXs、AOS和OPR2等是茉莉酸生物合成途徑中的重要酶基因，陳壽松[44]研究發(fā)現(xiàn)，LOX、AOC、OPR和ACX等基因在烏龍茶日光萎凋處理15 min時(shí)顯著上調(diào)，而在日光萎凋處理30 min和60 min時(shí)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。本研究日光萎凋處理23 min，CsLOX11和CsACX4顯著上調(diào)，CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2和CsACX8等5個(gè)基因顯著下調(diào)，在二次搖青時(shí)7個(gè)基因均呈上調(diào)趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)茶樹(shù)茉莉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶LOX、AOS和AOC基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)茉莉酸含量與CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1表達(dá)趨勢(shì)一致，烏龍茶加工過(guò)程中，大多數(shù)茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因在二搖后達(dá)到最高，說(shuō)明二次搖青是茉莉酸合成的主要時(shí)期。TPL是一類保守的植物轉(zhuǎn)錄輔抑制因子家族蛋白[45]，可參與植物非生物脅迫響應(yīng)以及茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[46]。本研究中，CsTPL6在烏龍茶加工過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，其表達(dá)量與茉莉酸含量呈正相關(guān)，表明CsTPL6在茉莉酸信號(hào)中被積極調(diào)節(jié)，與An等[47]研究一致。MYC2是茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最核心的轉(zhuǎn)錄因子，在控制創(chuàng)傷誘導(dǎo)的茉莉酸積累方面起核心作用[48-49]，茶樹(shù)MYC2響應(yīng)外源茉莉酸脅迫處理以及干旱脅迫處理，預(yù)示MYC2參與茶樹(shù)的各種非生物脅迫響應(yīng)[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21在萎凋和做青過(guò)程表達(dá)模式不同，但均在二次搖青后表達(dá)量達(dá)到最高，表明在響應(yīng)機(jī)械損傷脅迫方面較為突出。綜上所述，茶樹(shù)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因可響應(yīng)烏龍茶加工過(guò)程中多種脅迫，茉莉酸在響應(yīng)烏龍茶加工過(guò)程的脅迫中發(fā)揮著重要作用，其中，二次搖青是茉莉酸合成的主要時(shí)期。

3.2 茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因與烏龍茶萜類物質(zhì)形成相關(guān)

萜類化合物是植物遭受逆境脅迫影響后產(chǎn)生的通訊信號(hào)，提示植物啟動(dòng)防御系統(tǒng)，以此減輕脅迫帶來(lái)的負(fù)面影響[51]。有報(bào)道稱茉莉酸可以作為一種激活劑，通過(guò)促進(jìn)萜類化合物的合成來(lái)改善植物的香氣[19,35]。此外，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，與萜類化合物合成相關(guān)的基因表達(dá)水平增加，萜類化合物的含量增加[52-53]。本研究通過(guò)對(duì)鐵觀音鮮葉進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，茶樹(shù)茉莉酸合成途徑中CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1的表達(dá)趨勢(shì)與茉莉酸含量趨勢(shì)一致，而在烏龍茶萎凋和做青處理后，茉莉酸合成途徑中LOX、AOS、AOC和ACX上調(diào)表達(dá)，茉莉酸含量顯著上升。因此，烏龍茶加工過(guò)程可促進(jìn)茉莉酸大量積累，而高含量的茉莉酸通過(guò)茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因激活下游萜類化合物的合成，進(jìn)而促進(jìn)萜類化合物的積累。在萎凋葉和二搖青葉中，JAR和COI1上調(diào)表達(dá)，通過(guò)傳遞上游的茉莉酸信號(hào)，啟動(dòng)SCFCo11進(jìn)行JAZ的識(shí)別捕獲，被捕獲后的JAZ在26 S蛋白酶體作用下降解，從而抑制了JAZ的正常表達(dá)。隨后，JAZ對(duì)MYC2的抑制作用被解除，促進(jìn)了萎凋及二搖中MYC2轉(zhuǎn)錄水平的大幅上升。研究表明，高表達(dá)的MYC2可增強(qiáng)萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)萜類化合物的積累[54]。本研究結(jié)果表明，萎凋和做青處理激活茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了萜類化合物積累，與前人結(jié)果一致[55]，其中第二次搖青多數(shù)基因表達(dá)量達(dá)到較高水平，是茉莉酸合成的主要時(shí)期。本研究通過(guò)相關(guān)性分析驗(yàn)證茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因與萜類物質(zhì)含量變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該途徑關(guān)鍵基因CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2_15、CsMYC2_21等與β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯等萜類化合物呈正相關(guān)；CsOPR2、CsCOI1-12、CsTPL6、CsLUG4與反式-橙花叔醇、α-法尼烯、紫羅蘭酮等相對(duì)含量呈正相關(guān)。其中，CsTPL6與35種萜類化合物存在極顯著正相關(guān)，這些萜類物質(zhì)在殺青前攤放過(guò)程含量較高，主要呈花果香，說(shuō)明TPL輔抑制活性在茉莉酸信號(hào)中被積極調(diào)節(jié)，對(duì)萜類化合物的形成具有重要作用。同時(shí)，本研究中芳樟醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮和檸檬醛等花果香型物質(zhì)閾值低，ACI值較高，對(duì)烏龍茶花果香香氣貢獻(xiàn)度較大。因此，茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因與烏龍茶萜類物質(zhì)形成相關(guān)，特別是呈花果香型物質(zhì)。

綜上所述，本研究揭示了烏龍茶萎凋和做青過(guò)程的連續(xù)損傷可誘導(dǎo)茉莉酸合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)茉莉酸積累，以及該途徑基因參與調(diào)控烏龍茶加工過(guò)程中萜類化合物形成，為探明烏龍茶加工過(guò)程香氣形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。