小貫小綠葉蟬水狀唾液蛋白的鑒定及其參與茶樹(shù)“葉蟬燒”癥狀形成的初步研究

閆佳偉，陳宗懋，李兆群，羅宗秀，邊磊，蔡曉明*，金珊

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

唾液是昆蟲(chóng)生命活動(dòng)不可或缺的一部分，它是由唾液腺產(chǎn)生并在口腔分泌的一種液體，主要分為水狀唾液（Watery saliva）和膠狀唾液（Gel saliva）兩種類(lèi)型[1-2]。在昆蟲(chóng)和寄主植物的相互作用中，昆蟲(chóng)唾液作為兩者聯(lián)系的重要媒介，在昆蟲(chóng)取食寄主植物的階段，特別是探測(cè)和攝食過(guò)程中起重要作用[3]。昆蟲(chóng)分泌的唾液是一種混合物，它由多種具有生物活性的化合物組成，主要為蛋白質(zhì)和酶類(lèi)。刺吸式口器的昆蟲(chóng)在寄主植物的木質(zhì)部和韌皮部吸食汁液時(shí)會(huì)分泌水狀唾液，起到潤(rùn)滑口器、攝取食物、解毒和突破植物防御等作用[4-8]。隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些植食性昆蟲(chóng)的唾液成分被逐漸探明[9]。研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲(chóng)分泌的結(jié)構(gòu)蛋白和褐飛虱分泌的唾液鞘蛋白 NIShp是其順利取食的關(guān)鍵，此外還有唾液蛋白SHP、C002等[10-11]。然而，目前對(duì)一些昆蟲(chóng)唾液成分和其功能的探索仍然有限，特別是昆蟲(chóng)唾液中那些特有或廣泛存在的成分。

小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）是我國(guó)茶園中最重要的刺吸式口器害蟲(chóng)，其種群密度大、繁殖速度快且世代重疊嚴(yán)重，防治較為困難。葉蟬以口針穿刺細(xì)胞的方式取食茶茶葉葉肉和維管束薄壁細(xì)胞汁液[12-13]，主要為害茶樹(shù)的嫩梢或嫩莖部位，為害后會(huì)出現(xiàn)葉脈紅變、葉緣卷曲等癥狀，嚴(yán)重時(shí)茶樹(shù)芽葉會(huì)停滯生長(zhǎng)，葉片呈現(xiàn)焦枯狀，又稱(chēng)“葉蟬燒”（Hopperburn），嚴(yán)重影響了茶樹(shù)的正常生長(zhǎng)，進(jìn)而降低了茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，葉蟬爆發(fā)時(shí)可導(dǎo)致當(dāng)季茶園減產(chǎn)50%左右[14]。近年來(lái)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)對(duì)昆蟲(chóng)特定部位蛋白數(shù)據(jù)分析挖掘已成為研究熱點(diǎn)之一。Zhang等[15]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)，分析了麥長(zhǎng)管蚜（Sitobion avenae）唾液中的蛋白質(zhì)，共鑒定出了114種蛋白質(zhì)。Shao等[16]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析手段，分析小貫小綠葉蟬腸道消化酶，得到了7組共129個(gè)蛋白水解酶。Wu等[17]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)柑橘木虱（Diaphorina citri）的唾液和唾液腺進(jìn)行了聯(lián)合分析，在唾液和唾液腺中分別鑒定出246種和483種蛋白質(zhì)。盡管如此，目前還未見(jiàn)小貫小綠葉蟬水狀唾液蛋白的研究報(bào)道。本研究以小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)為研究對(duì)象，收集其水狀唾液，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析法鑒定葉蟬水狀唾液中的蛋白質(zhì)，旨在為葉蟬分泌蛋白、取食和突破植物防御等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

試驗(yàn)所用的小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)于試驗(yàn)前一天從浙江省杭州市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園（龍井43品種）抓捕，于實(shí)驗(yàn)室人工氣候室內(nèi)[溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]，飼養(yǎng)在采集的龍井43茶枝上。

1.2 水狀唾液收集

小貫小綠葉蟬的唾液收集方法采用雙層Parafilm膜夾營(yíng)養(yǎng)液法（圖1）。將Parafilm膜剪成6 cm×6 cm的小方塊，用75%酒精浸泡過(guò)夜后在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出、晾干，并在紫外燈下照射滅菌1 h。第1層膜用雙手拉住其兩側(cè)，在酒精燈旁稍微加熱，然后慢慢向兩邊拉伸，直至膜逐漸變薄透明時(shí)，小心將膜覆蓋在玻璃管（玻璃管內(nèi)徑5 cm，高10 cm，兩端開(kāi)口）管口上，壓實(shí)。用10 mL無(wú)菌注射器（Φ=0.2 μm）吸取2 mL 10%蔗糖溶液，用針頭式水系過(guò)濾膜過(guò)濾后滴加到Parafilm膜的中央位置。然后在蔗糖溶液上覆蓋第2層膜，操作同第1層膜，使兩層膜緊密接觸，適當(dāng)擠壓營(yíng)養(yǎng)液使其在兩層膜間鋪滿(mǎn)，并避免產(chǎn)生氣泡；再在第2層膜上覆蓋一層較厚的 Parafilm膜，起到保護(hù)作用。將50頭饑餓處理后（饑餓2 h）葉蟬成蟲(chóng)從玻璃管另一端放入，并在管口上覆蓋濕潤(rùn)的透氣紗布，用橡皮筋綁緊。依據(jù)上述方法制作3個(gè)相同的唾液收集裝置，然后將收集裝置放入人工氣候室中[溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]。待葉蟬取食24 h后，使用10 mL無(wú)菌注射器針頭穿過(guò)Parafilm膜上，緩慢吸出含有唾液的蔗糖溶液，將其轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，液氮預(yù)冷后儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱。試驗(yàn)共收集了5 000頭葉蟬成蟲(chóng)所取食過(guò)的蔗糖溶液。

圖1 小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)水狀唾液收集裝置Fig.1 Device for watery saliva collection of E.onukii adults

1.3 唾液蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

取適量樣品，并加入等量的SDT（4%SDS，100 mmol·L-1Tris/HCl pH7.6，0.1 mol·L-1DTT）裂解液，超聲（100 W，工作10 s，間歇10 s，循環(huán)10次），沸水浴10 min后，14 000 g離心10 min，保留上清液；取 20 μL的上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)束后染色。采用BCA法對(duì)純化后的水狀唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，結(jié)束后分裝蛋白質(zhì)樣品，于-80℃超低溫冰箱保存。

FASP酶解法（Filter-aided sample preparation）酶解蛋白，取上述濃縮提純的唾液蛋白，采用C18Cartridge對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽處理，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，最終對(duì)肽段進(jìn)行定量（OD280）。詳細(xì)方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.4 LC-MS/MS質(zhì)譜分析

按照上述定量結(jié)果，取適量酶解后產(chǎn)物，通過(guò)LC-MS/MS分析樣品。本試驗(yàn)中蛋白分析鑒定工作由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

樣品分析采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。95%的A相用作平衡色譜柱。樣品首先進(jìn)樣到色譜柱（Thermo scientific EASY column，2 cm×100 μm，5 μm-C18），再經(jīng)分析柱（Thermo scientific EASY column，75 μm×100 mm，3 μm，C18）分離檢測(cè)，流速為300 nL·min-1。液相梯度洗脫流程為0～50 min，B相0%～35%；50～55 min，B相 35%～100%；55～60 min，B相100%。

質(zhì)譜參數(shù)及其設(shè)置如下：檢測(cè)方式為正離子模式，母離子掃描范圍為300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000（m/z 200，質(zhì)荷比=200），自動(dòng)增益目標(biāo)值為3e6，一級(jí)最大注入時(shí)間為50 ms，多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比為每次全掃描（Full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17 500（m/z 200，質(zhì)荷比=200），微掃描為1，隔離窗口為2 m/z，二級(jí)最大注入時(shí)間為60 ms，MS2激活類(lèi)型為高能誘導(dǎo)解離，歸一碰撞能量為27 eV，動(dòng)態(tài)排除60.0 s，最小填充比為0.1%。

1.5 小貫小綠葉蟬唾液蛋白的鑒定

通過(guò)MaxQuant軟件，對(duì)原始文件（Raw file）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)選擇葉蟬科（Cicadellidae）UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）和飛虱科（Delphacidae）UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）。

蛋白質(zhì)搜庫(kù)參數(shù)設(shè)定如下：（1）酶為胰蛋白酶；缺失的裂解位點(diǎn)設(shè)為2；（2）固定修飾為Carbamidomethyl（C）；（3）動(dòng)態(tài)修飾設(shè)定Oxidation（M）和Acety（Protein N-term）。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定到的可信肽段和蛋白質(zhì)要通過(guò)設(shè)定的過(guò)濾參數(shù)FDR≤0.01。

1.6 小貫小綠葉蟬唾液蛋白的生物信息學(xué)分析

使用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理與分析，并用GraphPad Prism 8繪圖。采用Blast2Go（https://www.blast2go.com）軟件，通過(guò)基因本體（Gene ontology，GO）對(duì)所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋。通過(guò)KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有鑒定到的唾液蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。利用CELLO亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，對(duì)所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用InterProScan結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件對(duì)所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。利用CytoScape軟件，基于STRING或IntAct數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，對(duì)所有鑒定到的唾液蛋白質(zhì)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 小貫小綠葉蟬唾液蛋白處理茶苗

選用一年半生健康、無(wú)蟲(chóng)害的青心大冇茶樹(shù)盆栽苗進(jìn)行分組處理，比較其癥狀表現(xiàn)的差異。機(jī)械損傷處理（T4）：用00#昆蟲(chóng)針在芽下第二葉扎刺80針，造成葉片機(jī)械損傷，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。機(jī)械損傷+葉蟬水狀唾液蛋白處理（T1）：選取4盆機(jī)械損傷茶苗，將提取的葉蟬唾液蛋白（0.718 5 μg·μL-1）均勻地涂抹在機(jī)械損傷葉的葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。機(jī)械損傷+牛血清蛋白處理（T2）：選取4盆機(jī)械損傷茶苗，將牛血清蛋白（BSA標(biāo)準(zhǔn)品，上海吉至生化科技有限公司，1.00 μg·μL-1）均勻地涂抹在機(jī)械損傷葉的葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。葉蟬危害處理（T3）：選取健康的無(wú)蟲(chóng)害茶苗4盆，分別用透氣尼龍網(wǎng)罩罩住，每盆放入30頭葉蟬成蟲(chóng)。葉蟬水狀唾液蛋白處理（T5）：選取健康的無(wú)蟲(chóng)害茶苗4盆，將提純的唾液蛋白均勻涂抹在健康葉片兩面，處理后用透氣尼龍網(wǎng)罩覆蓋。將處理后的茶苗放在相同的條件下[溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(70±5)%，光周期L∶D=16∶8]處理48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉蟬唾液SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖2為小貫小綠葉蟬濃縮后唾液蛋白的一維電泳圖，電泳結(jié)果顯示，葉蟬唾液蛋白分子量主要分布在30～100 kDa。

圖2 小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)水狀唾液蛋白分離電泳Fig.2 Electrophoresis of proteins in the watery saliva of E.onukii adults

2.2 唾液蛋白的鑒定

利用LC-MS/MS對(duì)葉蟬唾液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，利用UniProt公共數(shù)據(jù)庫(kù)中葉蟬科（Cicadellidae）和飛虱科（Delphacidae）的數(shù)據(jù)與本研究鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。如圖3所示，與葉蟬科比對(duì)，共鑒定107個(gè)肽段和92個(gè)蛋白質(zhì)；與飛虱科比對(duì)，共鑒定91個(gè)肽段和76個(gè)蛋白質(zhì)；本研究重點(diǎn)關(guān)注葉蟬科比對(duì)的唾液蛋白質(zhì)，根據(jù)唾液蛋白質(zhì)的功能注釋和結(jié)構(gòu)域，將鑒定到的92個(gè)蛋白質(zhì)按功能大致分為7類(lèi)（表1）：（1）酶類(lèi)，包括水解酶、合成酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、氧化還原酶、抑制酶、內(nèi)肽酶、脫氫酶、蛋白激酶、ATP合成酶和RNA聚合酶等；（2）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等；（3）離子結(jié)合蛋白，包括陽(yáng)離子結(jié)合蛋白、鎂離子結(jié)合蛋白、鈣離子結(jié)合蛋白和鋅離子結(jié)合蛋白等；（4）DNA、RNA、蛋白質(zhì)、化合物、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物和酶結(jié)合或調(diào)節(jié)蛋白等；（5）骨架蛋白，包括微管細(xì)胞骨架、細(xì)胞骨架蛋白和聚合細(xì)胞骨架纖維等；（6）其他或非酶蛋白，包括細(xì)胞器部分、熱休克蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、組蛋白和肌動(dòng)蛋白等；（7）未表征蛋白質(zhì)。

表1 LC-MS/MS鑒定到的小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)水狀唾液蛋白質(zhì)Table 1 Waterysalivaryproteins of E.onukii adults identified by LC-MS/MS

續(xù)表1-2

續(xù)表1-3

圖3 葉蟬科與飛虱科的肽段總數(shù)和蛋白質(zhì)總數(shù)Fig.3 The total number of peptides and proteins of Cicadellidae and Delphacidae

2.3 GO功能注釋分析

為了明確蛋白質(zhì)在生物體中的功能、定位以及所參與的生物學(xué)途徑，我們通過(guò)基因本體（Gene ontology，GO）對(duì)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋。唾液蛋白GO功能注釋在第二水平主要分為3類(lèi)：生物過(guò)程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）[19]。圖4是葉蟬科數(shù)據(jù)比對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)果，GO功能注釋分析表明，有59個(gè)蛋白質(zhì)富集在生物過(guò)程的9個(gè)小類(lèi)中；有81個(gè)蛋白質(zhì)富集在分子功能的6個(gè)小類(lèi)中；有70個(gè)蛋白質(zhì)富集在細(xì)胞組分的11個(gè)小類(lèi)中。

圖4 小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)水狀唾液蛋白GO功能分類(lèi)圖Fig.4 Gene ontology classification of water salivary proteins in E.onukii adults

對(duì)比葉蟬科數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，分子功能中注釋的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，結(jié)合（Binding，GO:0005488）和催化活性（Catalytic activity，GO:0003824）是注釋蛋白質(zhì)較多的2個(gè)小類(lèi)，分別有42個(gè)和29個(gè)蛋白質(zhì)；其次是細(xì)胞組分中注釋的蛋白質(zhì)，這個(gè)部分的注釋類(lèi)別最多，有 11個(gè)小類(lèi)，其中細(xì)胞部分（Cell part，GO:0044464）和細(xì)胞（Cell，GO:0005623）是注釋蛋白質(zhì)較多的兩個(gè)小類(lèi)，均有15個(gè)；生物過(guò)程是注釋蛋白最少的一個(gè)大類(lèi)，細(xì)胞過(guò)程（Cellular process，GO:0009987）和代謝過(guò)程（Metabolic process，GO:0008152）是其注釋蛋白質(zhì)數(shù)量較多的2個(gè)小類(lèi)，分別有27個(gè)和20個(gè)。

2.4 KEGG通路分析

通過(guò)KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行解析注釋。本研究選取前20個(gè)蛋白質(zhì)所富集的KEGG途徑，以預(yù)測(cè)哪些通路中參與的蛋白質(zhì)數(shù)量最多（圖5）。葉蟬科比對(duì)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)數(shù)目較多的通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、脂肪酸延長(zhǎng)（Fatty acid elongation）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、丙酸鹽代謝（Propanoate metabolism）、RNA降解（RNA degradation）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）和吞噬體（Phagosome）。

在生物體內(nèi)，不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)并行使其生物學(xué)功能，我們?cè)谇耙徊窖芯康幕A(chǔ)上基于Pathway分析，有助于進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能富集不同層級(jí)的結(jié)果[20]。Pathway分析顯示，在葉蟬科比對(duì)的結(jié)果中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路上的蛋白質(zhì)最多（圖5），涉及的蛋白質(zhì)有熱休克蛋白83（A0A1B6FSZ4）和2個(gè)未表征蛋白質(zhì)（A0A1B6EU18、A0A1B6L8R6），未表征蛋白都具有一定的特征，本結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)未表征蛋白質(zhì)具有顯示區(qū)域和顯示蛋白質(zhì)盤(pán)繞線圈的特征。脂肪酸延長(zhǎng)通路上涉及到超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸蛋白質(zhì)（A0A1B6FUC0）和1個(gè)未表征蛋白（A0A1B6KZE3）。氧化磷酸化通路涉及到ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）和ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）。丙酸鹽代謝通路涉及CoA-連接酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（A0A1B6F7H0）和1個(gè)未表征蛋白（A0A1B6KZE3）。RNA降解通路涉及到2個(gè)未表征蛋白（A0A1B6LLI5，A0A1B6GWG5）。HIF-1信號(hào)通路涉及MFS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（A0A1B6IBR0）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（A0A1B6ERY9）。吞噬體通路中涉及含微管蛋白C結(jié)構(gòu)域蛋白（A0A1B6JSL4）和肌動(dòng)蛋白1（A0A125RA10）。其中還有其他比對(duì)到的通路，因涉及到人類(lèi)疾病相關(guān)通路，與本研究樣本物種不相關(guān)，故未進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

圖5 小貫小綠葉蟬成蟲(chóng)水狀唾液蛋白KEGG信號(hào)通路分析（Top20）Fig.5 KEGG pathway classification of watery salivary proteins in E.onukii adults (Top20)

2.5 唾液蛋白亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞器（Subcellular organelle）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微器官（如線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），它們具有一定的形態(tài)和功能，不同的亞細(xì)胞器行使不同的功能，同時(shí)它們也是蛋白質(zhì)發(fā)揮不同作用的重要場(chǎng)所。本研究發(fā)現(xiàn)，葉蟬科數(shù)據(jù)定位結(jié)果顯示，唾液蛋白都主要集中在細(xì)胞核（Nuclear）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasmic）和線粒體（Mitochondrial）中，本研究所收集葉蟬唾液的蛋白質(zhì)大多來(lái)源于細(xì)胞核中（圖6）。

圖6 唾液蛋白亞細(xì)胞器定位Fig.6 Subcellular organelles localization of salivary proteins

2.6 唾液蛋白結(jié)構(gòu)域分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（Domain）是保持其結(jié)構(gòu)獨(dú)特性的最基本單元。在蛋白質(zhì)相互作用中往往以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝?，若其?nèi)部氨基酸發(fā)生改變，可能引起蛋白質(zhì)關(guān)鍵性功能的變化。本研究對(duì)所有唾液蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，選取前20個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行展示。與葉蟬科比對(duì)結(jié)果顯示，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)富集較多，分別是延伸因子Tu-GTP結(jié)構(gòu)域（Elongation factor Tu GTP binding domain）、延伸因子Tu結(jié)構(gòu)域2（Elongation factor Tu domain 2）和ATP合成酶 α/β家族，核苷酸結(jié)合域（ATP synthase alpha/beta family，nucleotide-binding domain）；這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域所涉及到的蛋白質(zhì)有ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）、ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）、ATP-synt_ab結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A1B6HPD6）、延伸因子Tu，線粒體（A0A1B6IN76、A0A1B6IN76、A0A1B6I8F3）、延伸因子-1α（Q9NJ26）、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶（A0A1B6HWC4）和非特征蛋白質(zhì)（A0A1B6J3L8）（圖7）。

圖7 唾液蛋白結(jié)構(gòu)域分析圖（Top20）Fig.7 Analysis of salivary protein domain (Top20)

2.7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)之間的相互作用是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要方式之一。我們對(duì)鑒定到的唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白與蛋白相互作用（Protein protein interaction，PPI）分析。結(jié)果表明，連接度在“10”以上的蛋白質(zhì)有5個(gè)，分別是延伸因子-1α（Q9NJ26）、ATP合酶亞單位α（A0A1B6G670）、ATP合酶亞單位β（A0A1B6JZM5）、熱休克蛋白83（A0A1B6FSZ4）和1個(gè)顯示盤(pán)繞線圈特征的未表征蛋白質(zhì)（圖8）。

圖8 唾液蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Salivary protein interaction network

2.8 葉蟬唾液蛋白處理結(jié)果分析

從圖9可以看出，處理48 h后，不同處理組葉片呈現(xiàn)不同的變化。T3處理12 h時(shí)葉尖及其周?chē)娜~片邊緣稍微內(nèi)卷；24 h時(shí)大部分葉緣呈現(xiàn)內(nèi)卷狀態(tài)，葉脈開(kāi)始紅變，葉片質(zhì)地更柔軟，葉色暗淡，葉緣附近出現(xiàn)黃化；48 h時(shí)葉片呈現(xiàn)出了重度危害狀態(tài)，葉片柔軟似萎凋狀，葉尖和葉緣重度內(nèi)卷，幼嫩的芽頭首先出現(xiàn)葉蟬燒狀，葉色暗淡并失去光澤，葉片正在向紅褐色轉(zhuǎn)變，其中芽下一葉較為明顯。T1處理與T3處理的葉片變化趨勢(shì)基本一致，但主要集中在機(jī)械損傷針口附近，12 h時(shí)針口損傷處的葉片開(kāi)始紅變，葉緣稍卷曲；24 h時(shí)針口損傷處的面積增大，以針口為圓心逐漸向周?chē)鷶U(kuò)散并紅變，葉尖呈現(xiàn)卷曲狀，葉色逐漸開(kāi)始黃化；48 h時(shí)針口損傷附近的紅變程度進(jìn)一步增大，相鄰較近的針口連成一片，針口附近的葉脈紅變，葉緣卷曲并呈現(xiàn)黃化狀態(tài)，葉片光澤稍顯暗淡。葉蟬唾液蛋白處理后的葉片表觀癥狀主要集中在處理葉上，其他未處理葉片無(wú)明顯變化。而T2、T4和T5處理葉片在12、24 h和48 h時(shí)葉片均未出現(xiàn)包含葉蟬燒狀在內(nèi)的蟲(chóng)害癥狀，仍呈現(xiàn)挺立狀態(tài)且具有光澤，只是隨著時(shí)間的推移機(jī)械損傷口的面積逐漸增大，其原因可能與植物傷口愈合有關(guān)。

圖9 不同處理茶樹(shù)葉片變化Fig.9 Changes of tea leaves under different treatments

3 討論

刺吸式口器昆蟲(chóng)以其獨(dú)特的針狀口器吸食寄主植物的汁液，其分泌的唾液是連接兩者之間的重要媒介。昆蟲(chóng)分泌唾液有助于自身取食，唾液中的有效成分不僅可以幫助昆蟲(chóng)穿刺植物表皮，還參與了自身消化與解毒等反應(yīng)，所以昆蟲(chóng)唾液在昆蟲(chóng)與植物的互作和協(xié)同進(jìn)化中起到了關(guān)鍵性作用[21]。為了解小貫小綠葉蟬與茶樹(shù)之間的相互作用，我們利用LC-MS/MS對(duì)葉蟬的水狀唾液成分進(jìn)行了分析，由于小貫小綠葉蟬還沒(méi)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，因此我們將鑒定到的水狀唾液蛋白與葉蟬科蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定到92個(gè)蛋白質(zhì)，按不同功能將其分為7類(lèi)，酶類(lèi)的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，其可能在葉蟬生命活動(dòng)中具有重要作用。

目前有關(guān)刺吸式口器昆蟲(chóng)水狀唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究大多集中于蚜蟲(chóng)或飛虱上，關(guān)于葉蟬水狀唾液蛋白的研究較少。蚜蟲(chóng)水狀唾液蛋白中發(fā)現(xiàn)含有延伸因子、核糖體蛋白和ATP合酶等蛋白質(zhì)，這幾種蛋白質(zhì)在本研究中也都有鑒別到[22]。有研究表明刺吸式昆蟲(chóng)蝽類(lèi)的唾液酶常包括淀粉酶、蛋白酶和轉(zhuǎn)化酵素酶等；在馬鈴薯葉蟬的唾液中也發(fā)現(xiàn)了具有類(lèi)似淀粉酶一樣作用的酶，其主要功能是幫助昆蟲(chóng)將食物消化[23-24]。本結(jié)果中雖然沒(méi)有鑒定到淀粉酶，但是鑒定到了甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），該酶是糖酵解反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，所以推測(cè)該酶的主要作用是在葉蟬取食時(shí)與唾液一同分泌，參與食物消化[25]。此外，在代謝過(guò)程中鑒定到的硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、含ATP合酶結(jié)構(gòu)域蛋白、含烯醇化酶 N結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、含 MutL-C結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶、含RPOLD結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、組蛋白H4、40S核糖體蛋白S8、超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸蛋白質(zhì)、甲酰四氫葉酸脫氫酶、含Clp R結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)等，可能是為昆蟲(chóng)自身代謝過(guò)程提供底物和能量的蛋白質(zhì)。

Shao等[16]對(duì)小貫小綠葉蟬的唾液腺和腸道進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)半翅目昆蟲(chóng)腸道中的主要消化酶是半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，這與前人研究結(jié)果一致[26]。而在本研究中并沒(méi)有鑒定到這兩種消化酶，分析其主要原因是本研究鑒定的是體外蛋白，而Shao等[16]主要研究的是體內(nèi)蛋白，其保存效果和蛋白質(zhì)活性都會(huì)高于體外。Wu等[27]研究認(rèn)為，葉蟬唾液中的鈣離子結(jié)合蛋白是介導(dǎo)病毒從昆蟲(chóng)向水稻韌皮部傳播的載體，鈣離子結(jié)合蛋白減少，植物細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，進(jìn)而產(chǎn)生大量愈傷組織和過(guò)氧化氫，導(dǎo)致葉蟬頻繁的刺探植物，增加了病毒傳播。值得注意的是，本研究中也發(fā)現(xiàn)了鈣離子結(jié)合蛋白，但是有關(guān)葉蟬唾液在茶樹(shù)中傳播病毒的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。我們推測(cè)小貫小綠葉蟬的頻繁刺探并分泌唾液蛋白的行為也可能會(huì)使茶樹(shù)產(chǎn)生大量愈傷組織或胼胝質(zhì)，這一作用可能與葉蟬燒形成有關(guān)。Backus等[28]分析認(rèn)為，葉蟬口針刺吸過(guò)程會(huì)引發(fā)了植物傷口的反應(yīng)，釋放的唾液能夠加劇這一反應(yīng)，進(jìn)而形成葉蟬燒。本研究還發(fā)現(xiàn)了許多其他或非酶蛋白，其潛在功能還尚未挖掘，對(duì)于這些非特征蛋白質(zhì)還需進(jìn)一步研究。

本研究將提取到的葉蟬唾液蛋白涂抹在機(jī)械損傷處理的茶樹(shù)葉片傷口處，48 h后葉片出現(xiàn)了類(lèi)似葉蟬燒的癥狀，但局限于機(jī)械損傷的針口附近。單純的機(jī)械損傷、唾液蛋白和機(jī)械損傷+牛血清蛋白處理的茶樹(shù)葉片并未出現(xiàn)類(lèi)似葉蟬燒的癥狀。機(jī)械損傷和機(jī)械損傷+牛血清蛋白處理僅造成了葉片局部壞死，這種情況與健康植株的創(chuàng)傷反應(yīng)較為一致[26]。而機(jī)械損傷+葉蟬唾液蛋白處理引起的葉片癥狀與葉蟬危害后的葉片癥狀相似，但是沒(méi)有葉蟬危害的程度嚴(yán)重，可能因?yàn)槿~蟬取食是一個(gè)持續(xù)損傷的過(guò)程。與單純的機(jī)械損傷處理葉片相比，在葉片機(jī)械損傷處涂抹葉蟬唾液，會(huì)加重葉片的受害程度，可能由于葉蟬唾液中的某些物質(zhì)發(fā)揮作用，但具體是哪些物質(zhì)尚不清楚。后續(xù)將繼續(xù)挖掘相關(guān)蛋白質(zhì)，尋找出與葉蟬唾液中與葉片葉蟬燒形成相關(guān)的蛋白質(zhì)。

本研究首次獲得小貫小綠葉蟬水狀唾液蛋白的相關(guān)信息，鑒定到了多種已報(bào)到參與葉蟬生命歷程相關(guān)的蛋白質(zhì)，有些來(lái)源不確定或可能不是關(guān)鍵蛋白質(zhì)，但是它們?cè)谌~蟬的行為活動(dòng)中可能發(fā)揮著舉足輕重的作用。本結(jié)果為進(jìn)一步研究葉蟬與茶樹(shù)之間的互作關(guān)系提供了基礎(chǔ)信息。