CIRBP對小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的調(diào)控及機(jī)制研究*

趙嘉琪， 楊大春， 王強(qiáng)， 孫雄山△， 楊永健，△

CIRBP對小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的調(diào)控及機(jī)制研究*

趙嘉琪1， 楊大春2， 王強(qiáng)2， 孫雄山2△， 楊永健1，2△

（1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 610083）

探討冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRBP）對小鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖及遷移過程的調(diào)控及機(jī)制。將雄性C57BL/6J小鼠分為假手術(shù)對照組、假手術(shù)干擾組、頸總動脈損傷對照組和頸總動脈損傷干擾組，每組5只。造模后按照組別分別用陰性對照腺病毒（AD-NC）和沉默腺病毒（AD-I）轉(zhuǎn)染，28 d后觀察CIRBP表達(dá)及血管內(nèi)膜的增生情況。將小鼠VSMCs分為對照組和腺病毒沉默組，分別用AD-NC和AD-轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，然后加入激活雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）活性的胰島素。通過RT-qPCR檢測CIRBP的mRNA表達(dá)，Western blot檢測CIRBP、磷酸化核糖體蛋白S6（p-S6Ser235/236）和磷酸化4E結(jié)合蛋白1（p-4EBP1Thr37/46）蛋白水平變化，Ki67免疫熒光染色和CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移，HE染色檢測頸動脈內(nèi)膜增生程度。沉默后，VSMCs的活力下降，Ki67陽性細(xì)胞比率降低，細(xì)胞遷移速度減慢，同時mTORC1活性下降。加入胰島素恢復(fù)mTORC1活性后，細(xì)胞活力、Ki67陽性細(xì)胞率和細(xì)胞遷移速度下降幅度減弱。損傷小鼠頸總動脈內(nèi)皮后CIRBP表達(dá)增加，體內(nèi)干擾小鼠CIRBP表達(dá)后，小鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生程度減輕。CIRBP通過mTORC1途徑加強(qiáng)小鼠VSMCs增殖及遷移，促進(jìn)小鼠血管損傷后血管內(nèi)膜增生。

血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1

在我國，患心血管病的人數(shù)在迅速增加，其中動脈粥樣硬化性心血管病的患病率與死亡率逐年上升，并且有年輕化的趨勢［1-2］。經(jīng)皮冠脈介入治療（percutaneous coronary intervention， PCI）是主要解決方法，但術(shù)后血管再狹窄嚴(yán)重制約PCI的預(yù)后。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到機(jī)械損傷后，經(jīng)過內(nèi)皮剝落，血小板活化，促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放以及血管平滑肌細(xì)胞移動到內(nèi)皮下等過程，最終使血管內(nèi)膜增生，引起血管內(nèi)再狹窄［3］。當(dāng)前血管平滑肌細(xì)胞增殖的分子調(diào)控機(jī)制主要包括Ras/絲裂原活化蛋白激酶、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等［4］，針對血管內(nèi)再狹窄的治療手段進(jìn)步顯著，但術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生率仍有5%～10%［5］，提示仍有未知的分子機(jī)制需要探索。

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold-inducible RNA-binding protein， CIRBP）是一種冷休克相關(guān)蛋白，屬于RNA結(jié)合蛋白家族，在冷應(yīng)激等條件下可以促進(jìn)翻譯［6］。CIRBP能調(diào)控器官與組織細(xì)胞的生長、增殖和分化［7］、維持端粒酶活性［8］、抑制細(xì)胞凋亡［9］、促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的激活與釋放［10］。多個研究表明CIRBP在心力衰竭和血管損傷等心血管疾病中有重要意義［10-14］，當(dāng)血管受到各種損傷和病理因素刺激時，血管平滑肌細(xì)胞會從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只癄顟B(tài)，增殖異?；钴S，并進(jìn)一步向內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜增生及參與動脈粥樣硬化、肺動脈高壓等心血管疾病的進(jìn)展［15］。既往研究顯示CIRBP在乳腺癌、黑色素瘤、垂體腺瘤和胰腺導(dǎo)管腺癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用［16-19］。但是CIRBP對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和血管內(nèi)膜增生引起血管內(nèi)再狹窄的調(diào)控目前并不清楚。本研究通過機(jī)械損傷小鼠頸總動脈內(nèi)皮的方法構(gòu)建血管再狹窄模型，用腺病毒感染方法干擾CIRBP表達(dá)，探究CIRBP在小鼠VSMCs增殖、遷移和血管內(nèi)膜增生中的作用機(jī)制，為PCI術(shù)后防治血管再狹窄提供參考資料。

材料和方法

1　動物

20只約7周齡SPF級的雄性C57BL/6J小鼠，重約25g（成都藥康生物科技有限公司），許可證編號：SCXK（川）2020-034。小鼠先適應(yīng)性培養(yǎng)1周，白天適當(dāng)光照12 h，恒溫通風(fēng)，喂以水和食物。

2　細(xì)胞和主要試劑

小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞系MOVAS（深圳市豪地華拓生物科技有限公司）；RT-qPCR實驗試劑盒（TaKaRa）；RT-qPCR實驗所用的引物（成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶及青霉素+鏈霉素雙抗（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS）、5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）和CIRBP抗體（武漢三鷹生物科技有限公司）；4E結(jié)合蛋白1（4E-binding protein 1， 4EBP1）抗體、磷酸化4EBP1（phosphorylated 4EBP1， p-4EBP1Thr37/46）抗體、GAPDH單克隆抗體、核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6， S6）抗體、磷酸化S6（phosphorylated S6， p-S6Ser235/236）抗體和山羊抗兔Ⅱ抗（Cell Signaling Technology）；4'，6-二脒基2苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）和Ki-67抗體（Bioss）；重組人胰島素（Solarbio）；CIRBP腺病毒（上海吉凱基因有限公司）；ECL發(fā)光液（Millipore）；細(xì)胞活力及毒性檢測（CCK-8）試劑盒（Biosharp）；蘇木精-伊紅染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

3　主要方法

3.1VSMCs分組及干預(yù)用含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)VSMCs，將培養(yǎng)皿放在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞增殖到90%左右用0.25%胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，并且按照1∶2～1∶4傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。為觀察CIRBP對細(xì)胞增殖和遷移的影響，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將腺病毒復(fù)感染指數(shù)（MOI）定為100，按照分組分別向細(xì)胞中加入陰性對照腺病毒（AD-NC）和沉默腺病毒（AD-I）（105247-1），繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h，隨后用PBS沖洗2遍，換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)共孵育48 h。為進(jìn)一步探究CIRBP是否通過mTORC1調(diào)節(jié)VSMCs增殖及遷移，在沉默表達(dá)后，向相應(yīng)的組別中加入人重組胰島素（5 mg/L）孵育24 h。

3.2RT-qPCR測定CIRBP的mRNA表達(dá)用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用基因相對定量法標(biāo)準(zhǔn)化各組RNA濃度，接著反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)參照β-actin（NM_007393）的上游引物序列為5′-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3′，下游引物序列為5′-TGGTACGACCAGAGGCATACAG-3′；CIRBP（NM_007705）的上游引物序列為5′-AGCTCGGGAGGGTCCTACAG-3′，下游引物序列為5′?GAGGGCTTTTACTCGTTGTGTGT-3′［20］。

3.3Western blot檢測細(xì)胞CIRBP蛋白表達(dá)及反映mTORC1活性的底物S6和4EBP1的磷酸化水平用全蛋白提取試劑盒提取VSMCs蛋白，用BSA試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品進(jìn)行電泳，然后把蛋白轉(zhuǎn)至相應(yīng)孔徑的聚偏二氟乙烯膜，用牛血清白蛋白或者5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1 h，再加入對應(yīng)的抗體（CIRBP、4EBP1、p-4EBP1Thr37/46、S6、p-S6Ser235/236和GAPDH，稀釋比：1∶1 000）4 ℃孵育過夜。接著用緩沖液洗滌，然后加入山羊抗兔Ⅱ抗（稀釋比：1∶1 000），孵育1 h后，用緩沖液洗滌，接著加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，最后通過ImageJ分析條帶。

3.4CCK-8檢測細(xì)胞活力用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配成含有2×108/L的細(xì)胞懸液，鋪板到96孔板中，每個孔加100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞增殖到80%左右時每孔加入10 μL CCK-8溶液，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（），比較不同組間的細(xì)胞活力。

3.5Ki-67免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖將爬片放入6孔板中，加入配制好的細(xì)胞懸液，進(jìn)行干預(yù)后，倒掉培養(yǎng)液用PBS清洗3次，用5%BSA封閉30 min后加入Ⅰ抗Ki-67（稀釋比：1∶500），放入濕盒中4 ℃孵育過夜，再次用PBS清洗3次后加入熒光Ⅱ抗（稀釋比：1∶500），避光條件下室溫孵育1 h，PBS再次清洗后加DAPI染液避光室溫孵育10 min，用PBS清洗甩干后，用抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡采集圖像，記錄Ki-67陽性細(xì)胞率。

3.6劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移速度使用記號筆在6孔板背面大約每隔1 cm均勻劃一條豎線，每個孔劃3條豎線。向6孔板中加入一定數(shù)量的細(xì)胞，按照分組進(jìn)行干預(yù)，待細(xì)胞增殖到90%左右用無菌的規(guī)格為100 μL吸頭垂直于豎線劃一道痕，隨后用PBS洗滌細(xì)胞3遍，立刻拍攝時間點(diǎn)為0 h的細(xì)胞，接著加入無血清培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在12 h及24 h兩個時點(diǎn)用光學(xué)顯微鏡拍照，以劃痕的寬窄變化快慢測量細(xì)胞遷移率。

3.7小鼠分組及頸總動脈內(nèi)皮損傷模型的建立 用0.3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉已經(jīng)稱了重的小鼠，然后將麻醉好的小鼠固定于手術(shù)臺面上，把頸部毛發(fā)脫去后予以消毒處理，接著在頸正中做約1 cm的縱行切口，分離左頸總動脈，用粗糙導(dǎo)絲來回摩擦血管內(nèi)皮后，迅速取出導(dǎo)絲，結(jié)扎導(dǎo)絲穿刺點(diǎn)，縫合消毒切口［21］。將小鼠分為損傷對照組、損傷轉(zhuǎn)染組、假手術(shù)對照組和假手術(shù)轉(zhuǎn)染組，每組5只，損傷對照組和假手術(shù)對照組轉(zhuǎn)染陰性對照腺病毒AD-NC，損傷轉(zhuǎn)染組和假手術(shù)轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染腺病毒AD-I，在術(shù)后7、14和21 d通過尾靜脈繼續(xù)追加注射腺病毒；28 d后取出小鼠頸總動脈，標(biāo)記按組分裝。

3.8HE染色將各組小鼠的血管取材，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、染色、封片，拍照記錄，觀察對比血管結(jié)構(gòu)及內(nèi)膜增生程度。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，采用SPSS 21軟件分析數(shù)據(jù)。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示定量資料。選用獨(dú)立樣本檢驗進(jìn)行兩組間比較，選用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　對照組與腺病毒沉默組細(xì)胞中CIRBP表達(dá)比較

通過RT-qPCR實驗得到，與對照組相比，腺病毒沉默組中CIRBP的mRNA水平顯著下降（<0.01），同時Western blot實驗顯示，和對照組比較，腺病毒沉默組中的CIRBP蛋白表達(dá)亦顯著降低（<0.05），見圖1。

Figure 1.　The protein and mRNA levels of CIRBP were decreased in VSMCs transfected by AD-CIRBPI. A： the protein level of CIRBP was explored by Western blot； B： the mRNA expression of CIRBP was explored by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs AD-NC group.

2　干擾CIRBP的表達(dá)后小鼠VSMCs增殖和遷移情況

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾表達(dá)后細(xì)胞劃痕愈合速度減慢（<0.05），見圖2A。Ki-67免疫熒光染色顯示，和對照組相比，干擾表達(dá)顯著降低Ki-67陽性細(xì)胞率（<0.05），見圖2B。

Figure 2.　Silencing of CIRBP suppressed migration and proliferation of mouse VSMCs. A： the migration of the cells was explored by scratch test； B： the proliferation of VSMCs was explored by Ki-67 staining （α-SMA： α-smooth muscle actin）. Scale bar=50 μm. Mean± SD. n=5. *P<0.05 vs AD-NC group.

CCK-8實驗檢測顯示，干擾表達(dá)之后在450 nm處的吸光度顯著下降（<0.05），見表1。

表1　各組細(xì)胞活力比較

*<0.05AD-NC group.

3　干擾CIRBP的表達(dá)后，mTORC1的變化及小鼠VSMCs增殖和遷移情況

經(jīng)過Western blot實驗，結(jié)果顯示和對照組比較，干擾表達(dá)后，VSMCs中mTORC1底物p-4EBP1Thr37/46和p-S6Ser235/236蛋白水平顯著降低（<0.05或<0.01），見圖3。

Figure 3.　The activity of mTORC1 was reduced in VSMCs transfected with AD-CIRBPI. The protein levels of p-4EBP1Thr37/46， 4EBP1， p-S6Ser235/236 and S6 were explored by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs AD-NC group.

然而向VSMCs相應(yīng)組別中加入胰島素后mTORC1底物p-4EBP1Thr37/46和p-S6Ser235/236蛋白表達(dá)顯著增高（<0.01），此時Ki-67陽性細(xì)胞率（0.01）和細(xì)胞劃痕愈合速度（<0.05或<0.01）下降程度減慢，見圖4。

Figure 4.　The inhibitory effects of CIRBP silencing on migration and proliferation were attenuated after restoring the activity of mTORC1 by insulin. A： the protein levels of p-4EBP1Thr37/46 and p-S6Ser235/236 were explored by Western blot after restoring the activity of mTORC1 by insulin （n=3）； B： the migration of the cells was explored by scratch test after restoring the activity of mTORC1 by insulin （n=5）； C： the proliferation of the cells was explored by Ki-67 staining after restoring the activity of mTORC1 by insulin （n=5； α-SMA： α-smooth muscle actin）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P<0.05， **P<0.01 vs AD-NC group； #P<0.05， ##P<0.01 vs AD-CIRBPI group.

4　小鼠血管內(nèi)皮損傷后各組CIRBP表達(dá)及血管內(nèi)膜變化

進(jìn)一步行Western blot實驗顯示，和假手術(shù)組對比，頸動脈內(nèi)皮損傷組CIRBP表達(dá)顯著升高（<0.05），見圖5A，血管內(nèi)膜增厚，血管管腔狹窄；在頸動脈內(nèi)皮損傷的基礎(chǔ)上再干擾CIRBP表達(dá)，結(jié)果顯示內(nèi)膜增生及血管管腔再狹窄程度減輕，見圖5B。

Figure 5.　The expression of CIRBP and pathological changes of carotid artery in mice of different groups. A： the protein level of CIRBP was explored by Western blot； B： pathological changes of carotid artery were determined by HE staining （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham group.

討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是全世界發(fā)病率和死亡率的主要病因，PCI可讓一部分有阻塞性冠狀動脈疾病的患者獲益［22］，然而手術(shù)引起的血管內(nèi)再狹窄并發(fā)癥依舊無法完全避免，整個病理過程一方面可能與新生內(nèi)膜破裂、薄帽纖維彈性瘤形成、非閉塞性血栓形成等有關(guān)［23］；另一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后一氧化氮、前列環(huán)素等減少，組織因子和活性氧等表達(dá)增加，同時血管壁內(nèi)細(xì)胞釋放促炎因子等促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，位于中膜的血管平滑肌細(xì)胞被激活，增殖并遷移到內(nèi)皮下引起內(nèi)膜增生也是重要的病理基礎(chǔ)［3］，是預(yù)防血管內(nèi)再狹窄的關(guān)鍵之一。血小板衍生生長因子BB（platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB）是VSMCs表型轉(zhuǎn)化過程重要的刺激因子［15］，Sun等［24］的研究表明用20 μg/L的PDGF-BB處理血管平滑肌細(xì)胞之后會形成增殖型VSMCs，本實驗通過干擾表達(dá)，探討CIRBP對小鼠VSMCs增殖、遷移、血管內(nèi)膜增生的調(diào)控及有關(guān)機(jī)制。

CIRBP能和多種細(xì)胞內(nèi)信號分子相互作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如與能編碼晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器蛋白的RNA結(jié)合，促進(jìn)翻譯［25］；結(jié)合TLR4及其附屬蛋白MD2復(fù)合物引發(fā)炎癥反應(yīng)［14］；結(jié)合TLR4誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［26］。在心力衰竭患者和心肌梗死小鼠心臟中CIRBP表達(dá)降低，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增多［27］。Yang等［10］的研究結(jié)果顯示CIRBP通過刺激小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Nlrp3炎癥小體組裝和激活、caspase-1的激活以及促進(jìn)IL-1β的釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，而Nlrp3炎癥通路與新生血管內(nèi)膜增生密切聯(lián)系［28］。以上研究結(jié)果表明CIRBP在心血管病理調(diào)控中有重要意義，但在機(jī)械損傷血管內(nèi)皮后內(nèi)膜增生中的作用及機(jī)制并未提及。本研究觀察到增殖型VSMCs中CIRBP表達(dá)增加，腺病毒干擾表達(dá)后，可以抑制VSMCs的增殖和遷移，說明CIRBP正相調(diào)控VSMCs的增殖和遷移過程，然而調(diào)控的具體分子機(jī)制尚不清楚。

mTOR是絲/蘇氨酸激酶，在控制細(xì)胞代謝、生長和增殖等信號網(wǎng)絡(luò)中具有核心作用［29］。mTORC1是mTOR發(fā)揮效應(yīng)的多蛋白復(fù)合體之一，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖和自噬等［30］。CIRBP是否通過mTORC1調(diào)控VSMCs增殖和遷移尚不清楚。接著我們通過體外實驗進(jìn)一步研究了CIRBP和mTORC1的關(guān)系，干擾表達(dá)后，mTORC1下游的兩個核心底物S6和4EBP1的磷酸化水平均降低，表明了CIRBP正向調(diào)控mTORC1活性。然后根據(jù)分組加入胰島素［31］，觀察到干擾表達(dá)后S6和4EBP1的磷酸化水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明胰島素此時已激活mTORC1活性。當(dāng)mTORC1活性被恢復(fù)之后，通過一系列功能學(xué)實驗顯示干擾所致VSMCs增殖和遷移的抑制效應(yīng)被削弱，由此我們證明CIRBP可能通過mTORC1途徑發(fā)揮促進(jìn)小鼠VSMCs增殖及遷移的作用。

我們通過建立小鼠血管再狹窄的模型進(jìn)一步探究CIRBP在血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生中的作用。實驗結(jié)果顯示損傷組CIRBP蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，提示血管內(nèi)皮損傷后CIRBP表達(dá)量顯著增加，說明其在血管內(nèi)膜增生中可能發(fā)揮某種調(diào)控作用。用腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠干擾CIRBP表達(dá)后，CIRBP表達(dá)降低后血管內(nèi)膜增生及血管腔狹窄程度減輕，提示CIRBP促進(jìn)小鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生。

綜合以上實驗證明，CIRBP可能通過激活mTORC1途徑加強(qiáng)小鼠VSMCs增殖和遷移，加重血管內(nèi)皮損傷后血管再狹窄，為防治PCI術(shù)后血管再狹窄及改善經(jīng)皮冠脈介入治療的預(yù)后提供了參考資料，但對于分子機(jī)制還需深入研究。

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Regulatory effect of cold-inducible RNA-binding protein on proliferation and migration of mouse vascular smooth muscle cells and its mechanism

ZHAO Jiaqi1， YANG Dachun2， WANG Qiang2， SUN Xiongshan2△， YANG Yongjian1，2△

（1，，646000，；2，，610083，）

To investigate the regulatory effect of cold-inducible RNA binding protein （CIRBP） on the proliferation and migration of mouse vascular smooth muscle cells （VSMCs）， and to explore its mechanism.Male C57BL/6J mice were divided into 4 groups： sham+adenovirus-negative control （AD-NC） group， sham+adenovirus-inhibitor （AD-I） group， carotid vascular injury+AD-NC group， and carotid vascular injury+AD-I group， with 5 mice in each group. After the injury model was established， the mice were transfected with AD-NC or AD-I. The CIRBP expression and vascular intimal hyperplasia were measured at 28 d after injury. Mouse VSMCs were divided into AD-NC and AD-I group. The cells of these two groups were transfected with AD-NC and AD-I for 48 h， respectively. The activity of mammalian target of rapamycin complex 1 （mTORC1） was restored by insulin. The mRNA expression of CIRBP was explored by RT-qPCR. The levels of CIRBP， phosphorylated ribosomal protein S6 （p-S6Ser235/236） and phosphorylated 4E-binding protein 1 （p-4EBP1Thr37/46） were detected by Western blot. The cell proliferation was explored by Ki67 immunofluorescence staining and CCK-8 assay. The cell migration was determined by scratch test. The carotid intimal hyperplasia was determined by HE staining.The viability of VSMCs， the ratio of Ki67-positive cells， wound-healing rate and the activity of mTORC1 were decreased after silencing of. However， the inhibitory effects ofsilencingon cell viability， ratio of Ki67-positive cells and wound-healing rate were attenuated after restoring the activity of mTORC1 by insulin. The expression of CIRBP was increased after mouse common carotid vascular injury. The vascular intimal hyperplasia was attenuated after interfering with the expression of.CIRBP promotes the proliferation and migration of mouse VSMCs， and vascular intimal hyperplasia after mouse common carotid vascular injury through the mTORC1 pathway.

vascular smooth muscle cells； cell proliferation； cell migration； cold-inducible RNA-binding protein； mammalian target of rapamycin complex 1

R543.5； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.002

1000-4718（2023）02-0204-08

2022-09-16

2022-11-04

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（No.82070289）；四川省自然科學(xué)基金資助項目（No.2022NSFSC0820）

楊永健 Tel： 028-86571250； E-mail： yyj10001@126.com； 孫雄山 Tel： 028-86571255； E-mail： shan19910927@sina.com

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）