基于化學模式識別篩選清炒香附的差異標志物

楊顏溶，田瀚舉，李瑩瑩，賈 豪，雷敬衛(wèi)*，龔海燕*，謝彩俠

1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

2.河南省中藥質(zhì)量控制與評價工程技術中心，河南 鄭州 450046

香附最早記載于《名醫(yī)別錄》[1]，為莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖。《本草綱目》[2]記載：“生則上行胸膈，外達皮膚，熟則下走肝腎，外徹腰足。炒黑則止血，……青鹽炒則補腎氣，酒浸炒則行經(jīng)絡，醋浸炒則消積聚，姜汁炒則化痰飲”，表明清炒香附具有與輔料炮制香附不同的主治功效。中藥炒制方法多樣，包括清炒、麩炒、土炒等，香附清炒法最早見于《銀海精微》，記載香附清炒法的本草古籍達61 部[3]。香附雖為“女科要藥”，但其味辛而行氣力強，久用易耗傷根本之氣血，因此《妙一齋醫(yī)學正印種子編》中岳甫嘉多為炒用[4]。關于炒制程度，歷代古籍中多有提及“微炒”“炒焦”“炒黑”，用于治療不同病癥[3]，明代《醫(yī)學入門》[5]記載：“氣病略炒”，清代《藥品化義》[6]記載：“炒黑治淋漓及崩漏”，即不同清炒程度的香附確有不同主治功效。目前多為化學成分[7]、藥理[8-11]、輔料炮制、藥用部位以及產(chǎn)地等內(nèi)容的研究[12-17]，未見涉及清炒。

中藥指紋圖譜具有整體性和穩(wěn)定性的特點，是評價中藥質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性的有效方法[18]，能夠?qū)χ兴幍闹饕瘜W成分進行宏觀整體表征，層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等化學模式識別技術，能夠?qū)⒅讣y圖譜所含有的信息進行處理表達，同時避免主觀加權的弊端[19]。

基于以上內(nèi)容，為排除產(chǎn)地等方面的影響，選擇河南產(chǎn)地香附進行分析研究，采用高效液相色譜法（HPLC），結合化學模式識別，篩選出差異標志物，對香附飲片、清炒香附、香附炭的HPLC 指紋圖譜、指標成分等進行探討，以期為清炒香附藥效物質(zhì)基礎研究提供實驗依據(jù)，為進一步完善香附質(zhì)量標準提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；ME204E 型萬分之一分析天平、AB135-S 型十萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S6 型電子恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-700DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；FW-100 型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；101-3AB 型點熱恒溫鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

對照品α-香附酮（批號MUST-22041007）、香附烯酮（批號MUST-22011201）、阿魏酸（批號MUST-19032928），質(zhì)量分數(shù)均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司；對照品木犀草素，批號DST191020-032，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司；對照品對香豆酸（批號AF20041951）、5-羥基甲基糠醛（5-HMF，批號AF21030751），質(zhì)量分數(shù)均≥98.0%，成都埃法生物科技有限公司；甲醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司；磷酸，天津市利密歐化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

7 批香附藥材于2021年采集于河南省新鄭市大關村，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定為莎草科莎草屬植物莎草C.rotundusL.的干燥根莖，燎后直接曬干，切成厚片，備用。7 批凈香附飲片分別編號S1～S7。

2 方法與結果

2.1 樣品制備[4]

2.1.1 清炒香附 凈香附飲片（S1～S7）文火加熱，炒至內(nèi)部焦黃，取出，放涼，即得清炒香附（S8～S14）。

2.1.2 香附炭 凈香附飲片（S1～S7）中火加熱，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色，噴淋清水少許，滅盡火星，取出，放涼，即得香附炭（S15～S21）。

2.2 HPLC 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 Venusil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相，進行梯度洗脫：0～12 min，5%～20%甲醇；12～30 min，20%～30%甲醇；30～40 min，30%～48%甲醇；40～52 min，48%～50%甲醇；52～55 min；50%～59%甲醇；55～25 min；59%～70%甲醇；25～80 min；70%～77%甲醇；檢測波長：0～65 min，310 nm；65～80 min，254 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 樣品粉碎，精密稱取樣品粉末適量，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W、40 kHz）45 min，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、α-香附酮和香附烯酮對照品適量，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，定容，分別得到質(zhì)量濃度為549.3、370.7、326.7、119.3、220.0、193.3 μg/mL 的對照品溶液；分別量取6 種對照品溶液適量，配制成一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.2.4 精密度試驗 精密稱取香附炭樣品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定6 次，以α-香附酮為參照峰（S，較于其他成分峰面積大，峰形較好，故作為參照峰），計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別為0.49%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 精密稱取香附炭樣品（S15），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以α-香附酮為參照峰，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別為0.48%、0.37%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取香附炭樣品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以α-香附酮為參照峰，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別為0.49%、0.37%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定

2.2.7 指紋圖譜的建立、共有峰指認、相似度評價精密稱取香附樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，將所得數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以S21 樣品圖譜為參照，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正、Mark 峰匹配后生成21 批樣品的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），結果見圖1。通過與混合對照品指紋圖譜（圖2）比對，指認出峰3、10、11、17、21、23 分別為5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮。25 批香附樣品與R 的相似度分別為0.934、0.987、0.935、0.934、0.936、0.966、0.937、0.987、0.967、0.987、0.987、0.967、0.937、0.987、0.966、0.987、0.967、0.987、0.966、0.935、0.966，均不小于0.934。

圖1 21 批樣品的HPLC 疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜(R)Fig.1 HPLC overlay fingerprint and reference chromatogram(R)of 21 batches of samples

圖2 混合對照品的HPLC 圖Fig.2 HPLC of mixed reference substances

2.2.8 HCA 將23 個共有峰峰面積進行處理，導入SPSS.19.0 軟件，采用組間連接法，以歐氏距離為分類依據(jù)，對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖3。可知，當組間距離為2 時，21 批樣品可聚為3類：S1～S7 聚為一類，S8～S14 聚為一類；當組間距離為10 時，可聚為2 類。

圖3 21 批樣品的HCA 樹狀圖Fig.3 HCA tree view of 21 batches of samples

2.2.9 PCA 采用SIMCA 14.1 軟件對21 批樣品中23 個共有峰進行PCA，結果見圖4。結果顯示21 批樣品可聚為3 類：S1～S7 聚為一類，S8～S14 聚為一類。與HCA 結果一致。

圖4 21 批樣品的PCA 得分圖Fig.4 Score chart of PCA for 21 batches of samples

2.2.10 OPLS-DA 為進一步尋找影響不同樣品間差異的成分，以23 個共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進行OPLS-DA。結果顯示，R2X＝0.911、R2Y＝0.988、Q2＝0.982 均大于0.5，表明模型擬合度較好，具有較高的穩(wěn)定性與預測能力，結果見圖5?？芍?1 批樣品可分為3 類，與HCA 結果、PCA 結果一致；為避免建立的OPLS-DA 模型出現(xiàn)過度擬合而影響分析結果的準確性，利用200次置換試驗分別進行置換檢驗，結果見圖6，顯示置換后的R2＝-0.028 8＜0.3、Q2＝-0.438＜0.05，表明所建模型可靠，未出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象，可用于標志物的篩選。

圖5 21 批樣品的OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA score chart for 21 batches of samples

圖6 OPLS-DA 模型的200 次響應排序檢驗Fig.6 200-time response ranking test for OPLS-DA models

將23 個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，對各共有峰的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值進行分析，并以VIP＞1 為標準篩選貢獻較大的差異性成分[20]，結果見圖7?？芍?，VIP＞1 的共有峰依次為2、23（α-香附酮）、17（木犀草素）、10（對香豆酸）、11（阿魏酸），提示為導致樣品間差異的主要標志色譜峰。

圖7 23 個共有峰的VIP 值Fig.7 VIP value of 23 shared peaks

2.3 含量測定

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2.3”項下混合對照品溶液及“2.2.2”項下供試品溶液S10、空白溶劑（75%甲醇），按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄HPLC 指紋圖譜，結果見圖8。可知，供試品溶液、混合對照品溶液中各色譜峰的分離度良好，空白溶劑對測定無干擾。

圖8 供試品溶液(S10,A)、混合對照品(B)、空白溶劑(C)的HPLC 圖Fig.8 HPLC fingerprint of test solution(S10,A),mixed reference substances(B)and blank solvent(C)

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.3”項下各對照品溶液，5-HMF 對照品溶液依次稀釋3.0、7.5、75.0、150.0 倍，得到質(zhì)量濃度為183.1、73.2、7.3、3.7 μg/mL 的系列對照品溶液；對香豆酸對照品溶液依次稀釋1.5、2.0、2.5、4.0 倍，得到質(zhì)量濃度為24.7、18.5、14.8、9.3 μg/mL 的系列對照品溶液；阿魏酸對照品溶液依次稀釋1.5、2.0、3.0、6.0 倍，得到質(zhì)量濃度為216.7、163.4、108.9、54.5 μg/mL 的系列對照品溶液；木犀草素對照品溶液依次稀釋1.5、2.0、2.5、3.0 倍，得到質(zhì)量濃度為79.6、59.7、47.7、39.8 μg/mL 的系列對照品溶液；香附烯酮對照品溶液依次稀釋1.2、1.3、1.5、2.0 倍，得到質(zhì)量濃度為161.1、148.7、128.9、96.7 μg/mL 的系列對照品溶液；α-香附酮對照品溶液依次稀釋2.5、2.8、3.0、3.5 倍，得到質(zhì)量濃度為176.0、157.1、146.7、125.7 μg/mL 的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，經(jīng)計算得各成分的回歸方程與線性范圍分別為5-HMFY＝3 458.8X－0.153 1，r＝1.000 0，線性范圍3.7～549.3 μg/mL；對香豆酸Y＝8 478.2X－1.311 0，r＝0.999 6，線性范圍9.3～37.1 μg/mL；阿魏酸Y＝685.7X－0.107 1，r＝0.999 7，線性范圍54.5～326.7 μg/mL；木犀草素Y＝2 404.3X＋2.712 7，r＝0.999 6，線性范圍39.8～119.3 μg/mL；香附烯酮Y＝10 102X－5.920 0，r＝0.999 7，線性范圍96.7～193.3 μg/mL；α-香附酮Y＝31 040X＋11.946，r＝1.000 0，線性范圍125.7～220.0 μg/mL。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.2”項下香附炭供試品溶液（S15），按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的峰面積，計算5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮峰面積的RSD 分別為1.48%、1.67%、0.57%、0.98%、0.51%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下香附炭供試品溶液（S15），分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h 時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的峰面積，得5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮峰面積的RSD 分別為1.54%、0.97%、0.67%、0.16%、0.49%、0.28%，表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取香附炭樣品（S15），共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的峰面積，并計算含量，得5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮質(zhì)量分數(shù)的RSD 分別為2.19%、1.64%、0.79%、0.26%、0.37%、0.94%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的香附炭樣品（S15）9 份，分為3 組，分別按樣品中成分含量的50%、100%和150%加入對應成分的單一對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的峰面積并計算加樣回收率與RSD。計算得5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的平均加樣回收率分別為 98.17%、98.64%、97.68%、98.12%、98.69%、98.57%，RSD分別為1.69%、1.89%、1.34%、1.56%、1.49%、1.83%，表明方法準確度良好。

2.3.7 樣品測定 分別精密稱取21 批香附樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，并計算樣品中各指標成分含量，對香附飲片與清炒香附、香附炭中各成分含量的平均值進行比較，結果見表1、2。由表5 可知，5-HMF 含量在香附飲片、清炒香附、香附炭中逐漸增加，炒炭后5-HMF 明顯增加；對香豆酸、阿魏酸含量在香附飲片、清炒香附、香附炭中逐漸增加；清炒香附中木犀草素含量最高；香附烯酮含量在香附飲片、清炒香附、香附炭中呈下降趨勢；α-香附酮在香附炭中含量最低，香附飲片經(jīng)炒后α-香附酮含量略有增加。

表1 21 批香附樣品的質(zhì)量分數(shù)測定結果Table 1 Content determination results of 21 batches of Cyperi Rhizoma

表2 各成分平均質(zhì)量分數(shù)Table 2 Comparison of the average content of each ingredient

3 討論

HPLC 指紋圖譜研究結果顯示，21 批樣品的相似度均不小于0.934，共標定23 個共有峰，指認出3 號峰為5-HMF，10 號峰為對香豆酸，11 號峰為阿魏酸，17 號峰為木犀草素，21 號峰為香附烯酮，23號峰為α-香附酮；PCA 結果、OPLS-DA 結果與HCA結果一致，均可分為3 類，即香附飲片、清炒香附、香附炭存在一定差異，其規(guī)律符合中藥炮制基本原理[21]；通過VIP 法篩選出對樣品影響較大的成分，篩選出未知成分2 號峰和已知成分α-香附酮、木犀草素、對香豆酸、阿魏酸為差異標志物。

含量測定結果顯示，5-HMF、對香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮的質(zhì)量分數(shù)分別為3.7～518.0、10.2～24.6、56.4～147.5、40.8～67.7、121.9～134.4、149.1～160.2 μg/g；5-HMF 在香附炭中含量最高，推測與炮制程度有關[22-25]；對香豆酸、阿魏酸在香附飲片中含量最少，香附炭中含量最高，研究報道含有阿魏酸的藥材在體外干燥過程中會與阿魏酸松柏酯相互轉(zhuǎn)化[26]，推測與其有關；木犀草素在清炒香附中含量最高；α-香附酮含量經(jīng)炒后略有增加，有研究報道在炮制過程中，香附烯酮轉(zhuǎn)化為α-香附酮，致使其含量增加[27]，推測與其有關；香附烯酮含量在香附飲片、清炒香附、香附炭中含量逐漸減少，推測與炮制過程中揮發(fā)性成分損失有關[28]，提示在炮制的過程中應控制時間與溫度。

綜上所述，本研究篩選出未知成分2 號峰與已知成分α-香附酮、木犀草素、對香豆酸、阿魏酸為差異標志物；所建立的HPLC 指紋圖譜與含量測定方法操作簡單、準確，能夠為清炒香附藥效物質(zhì)基礎研究提供實驗依據(jù)，可為進一步完善香附質(zhì)量標準提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突