長鏈非編碼RNA TUG1對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為及放射敏感性的影響

廖志偉 朱建曼 周同沖 鄭榮輝

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州 510095）

鼻咽癌放射抗拒的機(jī)制尚不清楚，對放射抗拒鼻咽癌的識別和治療成為一個(gè)懸而未決的問題。預(yù)后評估對鼻咽癌患者做出更好的治療選擇至關(guān)重要，TNM 分期系統(tǒng)是決定鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。然而，相同疾病分期的患者在接受類似治療后，其臨床結(jié)果往往具有相當(dāng)大的差異，這表明TNM 分期仍遠(yuǎn)不能作為一個(gè)完美的預(yù)測指標(biāo)。因此，尋找鼻咽癌潛在的預(yù)后分子生物標(biāo)志物和放療相關(guān)的新靶點(diǎn)，對于發(fā)展有效的治療手段是必不可少的。

近年來，LncRNAs 及其在鼻咽癌發(fā)展中的作用備受關(guān)注［1］。其中一些lncRNA，如PVT1［2］、HOTAIR［3］和ANRIL［4］，被認(rèn)為在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TUG1（taurine upregulated 1）最早是在用?；撬崽幚硇∈笠暰W(wǎng)膜細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的上調(diào)lncRNA［5］。越來越多的證據(jù)表明TUG1 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［6-8］。最近的一項(xiàng)研究［9］發(fā)現(xiàn)TUG1 參與了鼻咽癌細(xì)胞的生長和侵襲。然而，其在鼻咽癌放射敏感性調(diào)節(jié)中的作用尚未完全明確。

本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)庫綜合分析了TUG1 在33 種人類癌癥中的表達(dá)特征和預(yù)后價(jià)值。隨后，通過檢測TUG1 在患者臨床標(biāo)本中的表達(dá)，以及采用MTS 法、transwell 實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討TUG1 在鼻咽癌中的作用及其潛在的預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)分析本研究33 種癌癥的基因組和臨床病理信息來自癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和Xena 數(shù)據(jù)庫（https：//xenabrowser.net/datapages/）。采用wilcox 檢驗(yàn)檢測各種癌癥中TUG1 的表達(dá)水平。

1.2 泛癌中TUG1 生存預(yù)后分析使用TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，研究TUG1 表達(dá)與總體生存（OS）、無病生存（DFS）、疾病特異性生存（DSS）、無進(jìn)展生存（PFS）的關(guān)系。

1.3 病人資料和組織樣本本研究使用的鼻咽癌組織和相應(yīng)的癌旁組織來源于2010-2012年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。所有鼻咽癌標(biāo)本均在接受根治性放射治療（伴或不伴化療）前采集。本組鼻咽癌患者包括65 例男性和28 例女性，表1總結(jié)了他們的臨床病理特征。平均隨訪時(shí)間為74 個(gè)月（中位數(shù)為77 個(gè)月；范圍9 ～233 個(gè)月）。所有患者的疾病分期按照美國國際癌癥控制聯(lián)盟癌癥聯(lián)合委員會第八版分期進(jìn)行重新分類。在這些臨床材料被用于研究之前，已經(jīng)得到了廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和寡核苷酸轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株（5-8F，6-10B，CNE-1，CNE-2）和人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69，按常規(guī)方法采用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640（Gibco）培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。用于敲除TUG1 的siRNA 及其陰性對照siRNA 購自Ambion 公司。siRNA 由Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen，Carlsbad，USA）按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，檢測TUG1 表達(dá)水平。siRNA 的目標(biāo)序列如下：

TUG1-siRNA sense 5′-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3′，antisense 5′-UAGAAUUGUUCUCUGGCUAUAUCCC-3′

1.5 RNA 提取和qPCR 分析使用TRIzol 試劑（Invitrogen）從組織或培養(yǎng)細(xì)胞系中提取總RNA。用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Promega，M1705）從總RNA 中合成cDNA。在MiniOpticonTM實(shí)時(shí)PCR 檢測儀器（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）上進(jìn)行qPCR 和數(shù)據(jù)收集。以GAPDH 作為TUG1 表達(dá)分析的內(nèi)參。

引物序列：正向引物：5“-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3”，反向引物：5“-CACAAATTCCCATCATTCCC-3”。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖試劑盒（Cell proliferation Reagent Kit，MTS）檢測細(xì)胞在12、24、48、72 h 的增殖情況。按照生產(chǎn)商的方案，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于96 孔板中（3 000 細(xì)胞/孔），每孔加入10 μL MTS 試劑，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光值。繪制增殖速度變化曲線。

1.7 細(xì)胞侵襲遷移試驗(yàn)為了進(jìn)行基質(zhì)入侵實(shí)驗(yàn)，在聚碳酸酯過濾器的上端涂上Matrigel 基質(zhì)。下室灌滿含血清培養(yǎng)基（600 μL）作為趨化劑。細(xì)胞被添加到Transwell 上室。培養(yǎng)48 h 后，用甲醇固定細(xì)胞，用結(jié)晶紫溶液染色。用棉簽擦去未侵入的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡下6 個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，以侵襲細(xì)胞數(shù)目表示腫瘤侵襲能力。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前1 d 將細(xì)胞接種于6 孔板形成單層細(xì)胞。用無菌200 μL 吸管頭損傷單層細(xì)胞形成人工劃痕，PBS 沖洗細(xì)胞，在5% CO237 ℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別于損傷后0、24、48 h 拍照觀察遷移情況。

1.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測定放射敏感性。將細(xì)胞接種在6 孔板上，將細(xì)胞按照不同的照射劑量（2 ～10 Gy）分別進(jìn)行射線照射。照射方法：使用6 MVX 射線（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心西門子PRIMUS 直線性加速器），劑量率為2 Gy/min。培養(yǎng)10 ～14 d 后，用甲醇固定、結(jié)晶紫染色。然后使用顯微鏡計(jì)數(shù)克隆數(shù)（＞50 細(xì)胞的群體）。采用GraphPad Prism 5軟件將數(shù)據(jù)擬合到線性二次模型。

1.10 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析si-TUG1或?qū)φ辙D(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后行細(xì)胞周期分析。胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基中和后離心細(xì)胞，用PBS 洗滌。用Annexin V 和7-AAD 染色，置于4 ℃暗室中15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。細(xì)胞凋亡分析用胰酶法收集細(xì)胞，PBS 洗滌3 次。收集細(xì)胞于4 ℃70%乙醇中固定過夜。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡百分率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析使用R v4.1.2 和SPSSv18.0 進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5 軟件計(jì)算后以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)組和對照組的比較采用Student′t檢驗(yàn)或單因素方差分析。TUG1 的表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，比較TUG1 高表達(dá)和低表達(dá)兩組生存率的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中TUG1 的表達(dá)差異利用TCGA 在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，較正常組織來說，TUG1在廣泛腫瘤組織中水平升高（圖1A），包括BLCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、STAD 和THCA（圖1A）。TUG1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中的33 種癌癥類型中差異高表達(dá)；其中ESCA 最高，LIHC 表達(dá)最低（圖1B）。

圖1 TUG1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫多種腫瘤的表達(dá)水平Fig.1 TUG1 in different cancers in TCGA database

2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中TUG1 的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析利用TCGA 在線數(shù)據(jù)庫，單變量cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)：在ACC 和LIHC 中，TUG1 的高表達(dá)與較差的OS 呈正相關(guān)，而在BLCA 和LGG 中與較好的OS 相關(guān)（圖2A）。對于DFS，在ACC 中，TUG1 的高表達(dá)與較差的生存率顯著相關(guān)（圖2B）。對于DSS，ACC、LIHC 中TUG1 高表達(dá)與較差的預(yù)后顯著相關(guān)，而LGG 和THYM 與較好的預(yù)后相關(guān)（圖2C）。對于PFS，在ACC、LIHC 和UVM 中，TUG1 的高表達(dá)與較差的PFS 呈正相關(guān)，而在GBM 和LGG 中與較好的PFS 相關(guān)（圖2D）。

圖2 使用單變量COX 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，TUG1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫不同癌癥中的預(yù)后價(jià)值Fig.2 Prognostic value of TUG1 in different cancers in TCGA database using univariate COX proportional hazard model

2.3 TUG1 在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)上調(diào)qRT-PCR 結(jié)果表明與非致瘤性NP69 細(xì)胞系相比，TUG1 的表達(dá)水平在5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2 四個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系都明顯增加（圖3A）。進(jìn)一步我們使用qRT-PCR 檢測TUG1 在鼻咽癌患者組織的表達(dá)水平。與配對的癌旁組織相比，TUG1在鼻咽癌原發(fā)組織標(biāo)本中的表達(dá)均顯著上調(diào)（圖3B）。為了評估TUG1 在鼻咽癌細(xì)胞的功能作用，選擇TUG1 表達(dá)相對高水平的CNE-1 CNE-2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染si-TUG1后qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)TUG1 在CNE-1 和CNE-2 細(xì)胞明顯減少（圖3 C）。

圖3 TUG1 在鼻咽癌細(xì)胞系和臨床標(biāo)本中表達(dá)情況Fig.3 TUG1 expression in nasopharyngeal carcinoma cell lines and clinical specimens

2.4 TUG1 高表達(dá)與鼻咽癌不良預(yù)后相關(guān)利用qRT-PCR 技術(shù)檢測了93 例鼻咽癌患者TUG1 的表達(dá)情況。相關(guān)性分析表明，TUG1 表達(dá)與pTNM 分期顯著相關(guān)（表1）。隨后的生存分析結(jié)果顯示，TUG1 高表達(dá)與總生存期（P= 0.02，圖4A）和無進(jìn)展生存期（P= 0.02，圖4B）相關(guān)。

表1 TUG1 表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between TUG1 expression and clinicopathological parameters in patients with nasopharyngeal carcinoma 例

圖4 TUG1 的表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后關(guān)系.Fig.4 Relationship between expression of TUG1 and prognosis of patients with nasopharyngeal carcinoma

2.5 下調(diào)TUG1 抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移為了確定下調(diào)TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)行了MTS 實(shí)驗(yàn)。下調(diào)TUG1 后12、24、48 和72 h 檢測細(xì)胞活力，結(jié)果表明下調(diào)TUG1 顯著抑制CNE1 和CNE-2 細(xì)胞增殖（圖5A）。隨后通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明，下調(diào)TUG1 降低了CNE-1 和CNE-2 細(xì)胞的侵襲能力（圖5B）。傷口愈合實(shí)驗(yàn)則顯示，下調(diào)TUG1 抑制了CNE-1 和CNE-2 的遷移能力（圖5C）。

圖5 TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig.5 TUG1 on the proliferation，migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells

2.6 下調(diào)TUG1 誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡但不影響細(xì)胞周期分布為檢測下調(diào)TUG1 對CNE-1、CNE-2細(xì)胞凋亡的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡百分率。結(jié)果表明與未轉(zhuǎn)染的CNE-1、CNE-2 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-TUG1 后CNE-1、CNE-2 細(xì)胞凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染了scramble siRNA 的CNE-1、CNE-2 細(xì)胞（si-control 組）（圖6A）。隨后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)TUG1 是否改變細(xì)胞周期分布。與si-control組相比，轉(zhuǎn)染si-TUG-1 的CNE-1、CNE-2 細(xì)胞處于S 期的比例與對照組大致相同（圖6B）。

圖6 采用流式細(xì)胞術(shù)分析TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響Fig.6 TUG1 on apoptosis and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cells was analyzed by flow cytometry

2.7 下調(diào)TUG1 增加鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性為了明確TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的作用，進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。見圖7，與對照組相比，轉(zhuǎn)染si-TUG1 后，CNE1 和CNE-2 細(xì)胞的存活率隨著輻射劑量的增加顯著降低。

圖7 采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測TUG1 對CNE1 和CNE2 細(xì)胞放射敏感性影響Fig.7 TUG1 on radiosensitivity of CNE1 and CNE2 cells was detected by colony formation test

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNA 可能在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、DNA 修復(fù)和代謝等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用［10］。近年來，lncRNA 與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究受到了人們的關(guān)注，如HOTAIR［11-12］、MALAT1［13］、NEAT1［14］等已被證實(shí)參與鼻咽癌的發(fā)生。既往研究表明TUG1 可以促進(jìn)乳腺癌［15］、卵巢癌［16］、前列腺癌［17］和黑色素瘤［18］等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，TUG1 在鼻咽癌中的表達(dá)模式和功能作用尚未得到全面的研究。泛癌分析結(jié)果顯示，TUG1 的表達(dá)在大多數(shù)癌癥中顯著上調(diào)，且其高表達(dá)在多種癌癥中預(yù)后較差，表明TUG1 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。臨床相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，TUG1 在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)；與QIAN 等［9］最近的一項(xiàng)研究一致。然而，有研究發(fā)現(xiàn)TUG1 在非小細(xì)胞肺癌［19］和膠質(zhì)瘤［20］組織中表達(dá)下調(diào)。TUG1 表達(dá)水平的差異反映了TUG1可能具有組織特異性，其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步研究探討。

本研究進(jìn)一步分析了TUG1 在鼻咽癌中的臨床意義，結(jié)果表明TUG1 在鼻咽癌中的高表達(dá)與腫瘤T 分期、N 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)組織中TUG1 的高表達(dá)可能預(yù)示著鼻咽癌患者預(yù)后較差。這些發(fā)現(xiàn)表明TUG1 可能是鼻咽癌診斷和個(gè)性化治療的潛在標(biāo)記物。推測TUG1 低表達(dá)的局部晚期鼻咽癌患者也許可以選擇減免化療的低毒治療方式。相反，TUG1 高表達(dá)的局部晚期鼻咽癌患者可能需要更高強(qiáng)度的治療。

為深入研究TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，進(jìn)行了MTS 實(shí)驗(yàn)、Transwell 實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)，與既往報(bào)道類似［21-23］，本研究發(fā)現(xiàn)TUG1 能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株的增殖、侵襲和遷移活性。表明TUG1 的表達(dá)與鼻咽癌的惡性程度相關(guān)，并參與了該疾病的發(fā)生和進(jìn)展。后續(xù)有必要深入探討TUG1 參與鼻咽癌細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制。

放射治療是鼻咽癌的主要治療方式。腫瘤細(xì)胞對放射治療的敏感性對疾病局部控制至關(guān)重要。在過去的十年中，大量研究表明lncRNA 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞放射敏感性［24-26］。國內(nèi)劉秀玲等［27］的研究表明，下調(diào)TUG1 表達(dá)可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性。為研究TUG1 對鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響，照射轉(zhuǎn)染si-TUG1 或陰性對照的鼻咽癌細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，下調(diào)TUG1 表達(dá)可以有效增加鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。

細(xì)胞對放射線的反應(yīng)與細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)［28］。此前有研究報(bào)道下調(diào)TUG1 所致的放射敏感性增加與凋亡信號的激活相關(guān)［29］。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相類似，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示下調(diào)TUG1 后人鼻咽癌細(xì)胞凋亡增加。然而流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，轉(zhuǎn)染si-TUG1 抑制CNE-1 和CNE-2細(xì)胞中TUG1 表達(dá)均不影響細(xì)胞周期分布。可見TUG1 在人鼻咽癌發(fā)病中潛在的致癌功能有待進(jìn)一步研究，其直接獲益的確切機(jī)制仍有待探索。

盡管本研究提高了我們對TUG1 在鼻咽癌中作用的認(rèn)識，但仍存在一些局限性。首先，樣本量相對較小，可能產(chǎn)生一定的偏差，后續(xù)評估TUG1與鼻咽癌預(yù)后關(guān)系，應(yīng)該通過更多數(shù)據(jù)集進(jìn)行交叉驗(yàn)證。其次，公共數(shù)據(jù)庫中缺乏臨床因素，如患者用藥和（或）手術(shù)治療的具體細(xì)節(jié)，也會影響患者的預(yù)后。第三，沒有構(gòu)建TUG1 過表達(dá)載體，并進(jìn)一步探討TUG1 過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)控作用。第四，TUG1 在鼻咽癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的直接作用有待于體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，其在鼻咽癌生長、轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制和作用有待進(jìn)一步研究。雖然本研究存在一定的局限性，但確實(shí)為研究TUG1 在鼻咽癌中的作用提供了線索，提示TUG1 在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，靶向TUG1 可能為鼻咽癌患者的臨床治療提供一種新的策略。

【Author contribution】LIAO Zhiwei：Conceptualization，Methodology，Writing-Original Draft，F(xiàn)unding Acquisition；ZHU Jianman：Formal Analysis，Writing-Original Draft；ZHOU Tongchong：Resources，Supervision；ZHENG Ronghui：Conceptualization，Writing-Review & Editing. All authors read and approved the final manuscript as submitted.