苗藥五香血藤提取物對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠NF-κB P65、iNOS表達(dá)的影響

李章春 寧燕 李珀 梁子聰 楊政敏 孫海波

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 都勻 558000;2貴州醫(yī)科大學(xué))

慢性非細(xì)菌性前列腺炎(CAP)是臨床男科前列腺炎最常見(jiàn)的類(lèi)型，占發(fā)病率的90%以上〔1〕，全球發(fā)病率為3%～16%〔2〕，在我國(guó)約占成年男性泌尿科門(mén)診疾病的33%〔3〕，患者臨床表現(xiàn)為尿急、尿頻、尿不盡等排尿異常，并伴隨腰骶部等酸賬不適，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。然而，CAP的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但免疫因素在CAP的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已被眾多研究所證實(shí)，由于老年人群機(jī)體免疫能力下降，且前列腺增生的高發(fā)進(jìn)一步加重了治療難度〔4〕。核因子(NF)-κB在免疫、炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)性作用，與細(xì)胞因子關(guān)系密切，已成為當(dāng)前研究疾病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)熱點(diǎn)〔5〕。目前，CAP的治療方法主要是α1-受體阻滯劑、抗生素、非甾體類(lèi)抗炎藥等，但此類(lèi)藥物易造成頭暈、皮膚過(guò)敏、胃腸出血等不良反應(yīng)，不宜長(zhǎng)期服用，且治療效果也并不理想〔6〕。中醫(yī)藥以療效好，不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，逐漸成為CAP治療藥物研發(fā)的新方向〔7,8〕。五香血藤是貴州常用的民間苗藥，具有抗腫瘤、消腫鎮(zhèn)痛等功效〔9〕，但有關(guān)五香血藤治療CAP的研究卻鮮有報(bào)道，本文通過(guò)觀(guān)察五香血藤提取物對(duì)CAP大鼠NF-κB P65、iNOS蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探究其治療CAP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性成年SD大鼠60只，體重200～220 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0013。大鼠隨機(jī)分為正常組，CAP模型組、陽(yáng)性藥物組、苗藥五香血藤提取物高劑量治療組(高劑量組)、中劑量治療組(中劑量組)、低劑量治療組(低劑量組)，每組10只，每籠5只，分籠飼養(yǎng)，自由取水、食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2藥物試劑與儀器 干五香血藤購(gòu)自貴州都勻市中藥材市場(chǎng)，廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院進(jìn)行質(zhì)控、鑒定和提取，方法：取五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，80 L 80%的乙醇萃取3次，取浸膏備用；消痔靈注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字Z22026175,吉林集安益盛藥業(yè)股份有限公司；前列舒通膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027140，保定天浩制藥有限公司。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-8水平，試劑盒購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Mindrady MR-96A。

1.3模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)〔10〕方法，乙醚麻醉大鼠，仰位固定于消毒鋪巾，在下腹正中部位行切口，提起膀胱，找到兩側(cè)前列腺，將25%消痔靈注射液分別注入前列腺背葉內(nèi)，各0.1 ml,逐層進(jìn)行縫合，模型形成期7 d，7 d后開(kāi)始給藥治療。

1.4給藥方法 參照文獻(xiàn)〔11〕換算，陽(yáng)性藥物組給予前列舒通膠囊水溶液灌胃治療，劑量20 ml/kg；苗藥五香血藤提取物高、中、低劑量組分別給予252、126、63 mg/kg劑量灌胃；正常組和CAP模型組給予無(wú)菌生理鹽水灌胃，劑量同陽(yáng)性藥物組，各組給藥1次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.5實(shí)驗(yàn)取材 末次給藥結(jié)束2 h后，稱(chēng)取各組大鼠重量，股動(dòng)脈取血，靜置，離心，取上清液備用。待處死大鼠后，置于操作臺(tái)剪下膀胱及前列腺，剔除脂肪和膀胱，濾紙吸干，稱(chēng)重，同時(shí)取肝臟、脾臟、胸腺、腎臟等器官，并計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重×100%)。

1.6標(biāo)本處理 取大鼠前列腺組織，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)常規(guī)的組織脫水、透明、浸泡、包埋、切片、脫蠟等處理，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下病理組織觀(guān)察分析。

1.7Western印跡檢測(cè)前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白表達(dá) 采用裂解法提取細(xì)胞總蛋白，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)將前列腺組織洗滌2～3次，細(xì)細(xì)剪碎組織置于勻漿管中，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白含量，各組取等量蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉1 h，加入NF-κB P65(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)一抗，4℃孵育過(guò)夜，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，加入二抗，室溫下孵育30 min，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageJ軟件分析灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)含量(即目的蛋白灰度值/β-actin內(nèi)參蛋白灰度值)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組前列腺指數(shù)比較 給藥結(jié)束后，與CAP模型組比較，除低劑量組外其余各組前列腺指數(shù)均明顯降低(P<0.05)；高劑量組與陽(yáng)性藥物組差異性不顯著(P>0.05)，兩組前列腺指數(shù)逐漸接近正常組，見(jiàn)表1。

2.2各組前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組比較，其余各組前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與CAP模型組比較，除低劑量組NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量，其余各治療組NF-κB P65、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，僅高劑量組與其差異性不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.3各組血清TNF-α、IL-6和IL-8含量比較 與CAP模型組比較，其余各組TNF-α、IL-6和IL-8含量均明顯降低(P<0.05)，與陽(yáng)性藥物組比較，高劑量組血清TNF-α、IL-6和IL-8含量差異性不顯著(P>0.05)，且兩組含量逐漸接近正常組，見(jiàn)表1。

表1 各組前列腺指數(shù)、組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量及血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比較

1～6:CAP模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，陽(yáng)性藥物組，正常組圖1 Western印跡檢測(cè)前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白表達(dá)

2.4各組肝、脾、腎臟器指數(shù)比較 與CAP模型組比較，陽(yáng)性藥物組和高劑量組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)差異性顯著(P<0.05)，各組脾臟指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，高劑量組肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)，而脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.5各組前列腺組織病理學(xué)觀(guān)察 鏡下可見(jiàn)，正常組前列腺組織病理學(xué)觀(guān)察未見(jiàn)異常改變；CAP模型組前列腺組織內(nèi)腺體上皮細(xì)胞明顯增生，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管充血，大量纖維組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；低劑量組前列腺組織內(nèi)仍可見(jiàn)腺體上皮細(xì)胞增生及較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但其增生及浸潤(rùn)的程度較模型組有所減輕；中劑量組前列腺組織的腺體輕度增生，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，纖維組織增生緩解，較低劑量組有所減輕；高劑量組前列腺組織的腺體上皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯增生，纖維組織增生及炎癥細(xì)胞滲出病變明顯減輕，病理改變接近陽(yáng)性藥物組，見(jiàn)圖2。

表2 各組臟器指數(shù)比較

正常組

CAP模型組

陽(yáng)性藥物組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

3 討 論

2016年，國(guó)務(wù)院頒發(fā)了《國(guó)務(wù)院關(guān)于印發(fā)中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016～2030年)的通知》(簡(jiǎn)稱(chēng)通知)〔12〕，強(qiáng)調(diào)要加強(qiáng)中醫(yī)藥科學(xué)研究，加強(qiáng)對(duì)常見(jiàn)病、多發(fā)病、慢性病的中醫(yī)藥防治研究，針對(duì)疾病新的藥物靶標(biāo)，在中藥資源中尋找新的候選藥物。近年來(lái)，在CAP的藥物治療中，中醫(yī)藥因具有雙向調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在減輕炎癥、緩解患者盆腔疼痛中發(fā)揮了重要作用〔13〕。五香血藤屬五味子科為木質(zhì)藤本植物，具有理氣止痛、活血消腫等功效，主要活性成分是木脂素，有抗氧化、解熱、安定等作用，用于治療無(wú)名腫毒、咽喉腫痛、跌打損傷等〔14〕，但目前有關(guān)五香血藤藥物應(yīng)用的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究還并不多見(jiàn)。本研究結(jié)果表明，五香血藤可能通過(guò)抑制NF-κB P65、iNOS蛋白表達(dá)，參與了CAP大鼠的炎癥調(diào)解。

NF-κB是一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，在細(xì)胞發(fā)育、促增殖、炎癥反應(yīng)、腫瘤形成等免疫性疾病中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，是重要的信號(hào)通路〔15〕。通常情況下，NF-κB在正常細(xì)胞中處于失活狀態(tài)，它主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白(I-κB)結(jié)合，存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞因子、活性氧等多種刺激，使I-κB被誘導(dǎo)磷酸化，p50/p65解離，使NF-κB活化，據(jù)研究顯示〔16，17〕，p65能夠與下游TNF-α、IL-6等靶基因結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)子區(qū)域，使這些基因的轉(zhuǎn)錄水平被提高。在NF-κB與前列腺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)〔18〕，在前列腺癌形成期間NF-κB表達(dá)水平逐漸增加，腫瘤一旦形成NF-κB會(huì)表現(xiàn)出過(guò)度活化現(xiàn)象，前列腺癌的發(fā)病與慢性前列腺炎具有高度相關(guān)性〔19〕。一氧化氮合酶分為nNOS、iNOS、eNOS 3種亞型，其中iNOS和一氧化氮(NO)是NF-κB信號(hào)通路中兩種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，構(gòu)成了機(jī)體重要的氧化應(yīng)激通路，即NF-κB/iNOS-NO信號(hào)通路，與炎癥損傷、氧化損傷關(guān)系十分密切，能夠放大炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)，激活炎癥介質(zhì)趨化，使TNF-α、IL-1、IL-8等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)釋放〔20，21〕。iNOS和前列腺炎的關(guān)系研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激可能是Ⅲ型前列腺炎的重要發(fā)病因素之一〔22〕。本研究結(jié)果表明，五香血藤提取物能夠?qū)AP大鼠炎癥起到緩解作用。

綜上，苗藥五香血藤提取物能夠?qū)AP大鼠前列腺組織內(nèi)NF-κB P65、iNOS蛋白的表達(dá)起到抑制作用，通過(guò)下調(diào)TNF-α、IL-6和IL-8含量，改善組織學(xué)損傷，降低炎癥水平。