circ_POLA2靶向miR-330-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移能力的影響

羅方接 張代龍 鄧景陽 陳亞德 曾志明 祝展鵬

(東莞市松山湖中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 東莞 523320)

腦膠質(zhì)瘤具有惡性程度高與侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，患者5年生存率較低，目前腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未闡明〔1,2〕。環(huán)狀RNA(circRNA)是由5′端與3′端以共價(jià)鍵形成的閉合環(huán)狀RNA分子，其不易被RNaseA降解且具有組織特異性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)，已知circRNA在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，并可充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿分子而負(fù)向調(diào)控miRNA的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為〔3,4〕。circ_POLA2在肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可通過調(diào)控miR-326/GNB1軸而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移〔5〕。但circ_POLA2與腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)報(bào)道研究相對(duì)較少。Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_POLA2與miR-330-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖〔6〕。但circ_POLA2/miR-330-5p軸在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未可知。本研究主要探討circ_POLA2是否可通過靶向調(diào)控miR-330-5p而影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 收集2019年1月至2020年5月東莞市松山湖中心醫(yī)院腦科手術(shù)切除的46例腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁組織標(biāo)本，其中男26例，女20例，年齡50～68歲，平均(55.49±6.77)歲，所有患者為初次診治患者且經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤，患者術(shù)前均為接受放化療治療。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書。人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibco；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；circ_POLA2小分子干擾RNA(si-circ_POLA2)及陰性對(duì)照(si-NC)、miR-330-5p寡核苷酸模擬物(miR-330-5p mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、miR-330-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-330-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物；pcDNA、pcDNA-circ_POLA2購自廣州復(fù)能基因；CCK-8、基質(zhì)膠、Transwell小室購自北京索萊寶；葡萄糖消耗量購自北京普萊利基因；乳酸檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 T98G細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基分別稀釋轉(zhuǎn)染物：si-NC、si-circ_POLA2、miR-NC、miR-330-5p mimics、si-circ_POLA2與anti-miR-NC、si-circ_POLA2與anti-miR-330-5p，充分混勻后室溫孵育5 min，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將Lipofectamine2000稀釋液與轉(zhuǎn)染物稀釋液充分混勻室溫靜置20 min，將二者混合溶液按照每孔400 μl的密度加入6孔板，6 h后棄舊培養(yǎng)基并更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為si-NC組、si-circ_POLA2組、miR-NC組、miR-330-5p組、si-circ_POLA2+anti-miR-NC組、si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)circ_POLA2、miR-330-5p的表達(dá)水平 用Trizol試劑提取組織標(biāo)本與T98G細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green PCR試劑用于進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_POLA2、miR-330-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組T98G細(xì)胞(2×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入20 μl CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度值(OD)。

1.2.4檢測(cè)葡萄糖消耗量、乳酸生成量 收集各組T98G細(xì)胞培養(yǎng)基，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖濃度，葡萄糖消耗量=培養(yǎng)基本底葡萄糖濃度-實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基葡萄糖濃度；用乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸濃度，乳酸生成量=培養(yǎng)基本底乳酸濃度-實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基乳酸濃度。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板內(nèi)接種各組T98G細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/孔)，用標(biāo)記筆在6孔板后面劃橫線(間隔0.5～1.0 cm)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用移液槍槍頭比對(duì)直尺垂直橫線劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后加入不含血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0 h與24 h取樣拍照〔劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%〕。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲 基質(zhì)膠稀釋液加入小室的上室(40 μl/孔)，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h后加入各組T98G細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)，下室加入600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽除去膜表面殘留，PBS洗滌后用甲醇固定20 min，棄甲醇后加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，于顯微鏡下觀察并拍照(取5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)平均值)。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及RNA免疫沉淀(RIP)檢測(cè)circ_POLA2與miR-330-5p的靶向關(guān)系 根據(jù)psiCHECK2載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成野生型WT-circ_POLA2與突變型MUT-circ_POLA2并分別連接于psiCHECK2載體，擴(kuò)增后提純，分別將WT-circ_POLA2、MUT-circ_POLA2與miR-NC、miR-330-5p mimics共轉(zhuǎn)染至T98G細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。RIP實(shí)驗(yàn)：取T98G細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集上清后加入800 μl NT-2緩沖液，依次分別加入Argonaute RISC催化組分(Ago)2抗體(20 μg)或免疫球蛋白(Ig)G抗體(20 μg)，同時(shí)取出10 μl樣品作為Input備份，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，抗體孵育3 h后離心10 min，冰上孵育1 min，棄上清，加入2×蛋白上樣緩沖液(10 μl)，沸水煮5 min，冰上孵育1 min，獲得沉淀即成為RIP沉淀，用qRT-PCR法檢測(cè)RIP沉淀中circ_POLA2與miR-330-5p的表達(dá)量。

1.2.8Western印跡檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 收集各組T98G細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液后于4℃搖床上孵育30 min，4℃條件下經(jīng)12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液即為總蛋白，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測(cè)蛋白濃度后加入上樣緩沖液煮沸變性，按照每孔20 μl的密度加入上樣孔，目的蛋白分離后終止電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)與GAPDH(1∶2 000)抗體溶液孵育PVDF膜過夜，次日，室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h，加入化學(xué)發(fā)光劑后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1circ_POLA2與miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)性 與癌旁組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織中circ_POLA2表達(dá)明顯升高，miR-330-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表1。circ_POLA2與miR-330-5p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.896 4，P<0.001)。

2.2干擾circ_POLA2表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞增殖及糖酵解水平的影響 與si-NC組比較，si-circ_POLA2組細(xì)胞活力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 circ_POLA2與miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

表2 干擾circ_POLA2表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞糖酵解水平的影響

2.3干擾circ_POLA2表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞遷移及侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circ_POLA2組劃痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 Western印跡檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表3 干擾circ_POLA2表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞遷移及侵襲的影響

2.4circ_POLA2靶向調(diào)控miR-330-5p circ_POLA2與miR-330-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。miR-330-5p過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-circ_POLA2的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_POLA2的熒光素酶活性，見表4。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ_POLA2可結(jié)合miR-330-5p，見表5。與pcDNA組(1.00±0.04)比較，pcDNA-circ_POLA2組miR-330-5p表達(dá)量明顯降低(0.38±0.04，P<0.05)；與si-NC組(1.00±0.05)比較，si-circ_POLA2組miR-330-5p表達(dá)量明顯升高(2.28±0.17，P<0.05)。

圖2 Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_POLA2與miR-330-5p存在結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

表5 RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5miR-330-5p過表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞增殖、糖酵解水平、遷移及侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-330-5p組細(xì)胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、劃痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低，24、72 h侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(均P<0.001)，見表6、圖3。

表6 miR-330-5p過表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞糖酵解水平、遷移及侵襲的影響

圖3 miR-330-5p過表達(dá)對(duì)T98G細(xì)胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的影響

2.6抑制miR-330-5p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_POLA2對(duì)T98G細(xì)胞增殖、糖酵解水平、遷移及侵襲的抑制作用 與si-circ_POLA2+anti-miR-NC組比較，si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組細(xì)胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯升高，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多(均P<0.001)，見圖4、表7。

1，2：si-circ_POLA2+anti-miR-NC組,si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組圖4 抑制miR-330-5p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_POLA2對(duì)T98G細(xì)胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的作用

表7 抑制miR-330-5p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾circ_POLA2對(duì)T98G細(xì)胞糖酵解水平、遷移及侵襲的抑制作用

3 討 論

circRNA屬于新型非編碼RNA分子，主要分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA等，其廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，既往研究顯示circRNA在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并可能作為腦膠質(zhì)瘤診斷及治療的潛在靶點(diǎn)，例如，circ-SMAD7通過上調(diào)PCNA促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔7〕。circSCAF11通過miR-421/SP1/VEGFA軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生〔8〕。CircZNF60/miR-134-5p/BTG-2軸可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔9〕。circ-MAPK4通過充當(dāng)miR-125a-3p的海綿分子而調(diào)控MAPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔10〕。circ_0008225通過充當(dāng)miR-890的海綿分子而促進(jìn)ZMYND11表達(dá)進(jìn)而抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展〔11〕。

circ_POLA2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，其可通過調(diào)控miR-326/GNB1軸而促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔12〕。但circ_POLA2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果提示，干擾circ_POLA2表達(dá)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。有氧糖酵解主要是指在氧氣充足時(shí)腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝是以糖酵解為主，當(dāng)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷罂僧a(chǎn)生三磷酸腺苷而滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)能量的需求，糖酵解可為腫瘤細(xì)胞生物大分子合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，研究顯示有氧糖酵解是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的重要原因之一〔13〕。本研究結(jié)果提示，干擾circ_POLA2表達(dá)可能通過降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解水平而抑制細(xì)胞增殖進(jìn)而抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)展進(jìn)程。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其可降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔14〕。本研究結(jié)果提示，干擾circ_POLA2表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲。

本研究結(jié)果提示，circ_POLA2可能通過吸附miR-330-5p而參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程。研究表明miR-330-5p通過靶向ITGA5抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲〔15〕。circ_0008532通過調(diào)節(jié)miR-155-5p/miR-330-5p/MTGR1軸促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展〔16〕。circSFMBT1通過靶向miR-330-5p/PAK1軸促進(jìn)胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移〔17〕。circ_0025033通過調(diào)節(jié)miR-330-5p/KLK4軸促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展〔18〕。表明miR-330-5p在腫瘤中呈低表達(dá)，并可能發(fā)揮抑癌基因作用，同時(shí)miR-330-5p基因序列上含有多個(gè)circRNA的結(jié)合位點(diǎn)，即多個(gè)circRNA可能通過吸附miR-330-5p而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果提示circ_POLA2可通過靶向miR-330-5p而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。