氣相色譜-電子捕獲檢測器分析葡萄酒中的8種生物胺

楊 靜，王 琨，周 元

（1.楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

生物胺是一類含有胺基的有機物的統(tǒng)稱，常見的生物胺類型包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、酪胺、β-苯乙胺、組胺和色胺[1]。生物胺在葡萄酒中普遍存在，主要由具有氨基酸脫羧酶活性的微生物對游離氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生。攝入過量生物胺會對機體產(chǎn)生神經(jīng)毒性，典型癥狀為頭疼、心悸、嘔吐、血壓升高、呼吸紊亂等[2]，因此，葡萄酒中生物胺的定量分析已成為食品安全研究的一項重要內(nèi)容。在上述8種生物胺中，組胺和酪胺的毒性最強[3]，并且乙醇會加劇其毒性作用[4]，因此澳大利亞、法國和德國已分別對葡萄酒中的組胺含量制定了10mg/L、8mg/L和2mg/L的限量值要求[5]，而我國目前還尚未對葡萄酒中的生物胺做出限量要求。

由于葡萄酒中生物胺檢測的重要性，目前研究者已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)手段用于分析葡萄酒中生物胺的方法，其主要可以分為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[6-8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[9-11]兩大類。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析生物胺時不需要對樣品進行衍生，具有簡單和快速的技術(shù)優(yōu)勢，但設(shè)備昂貴，普及率不高，并且基質(zhì)效應(yīng)常對定量產(chǎn)生干擾[10-11]。相比之下，高效液相色譜法的使用頻次最高，國標(biāo)GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》同樣采用該方法對食品中的生物胺水平進行分析[12]。由于部分生物胺（主要是脂肪族生物胺）具有極低的紫外或熒光響應(yīng)，通常需要采用丹磺酰氯[13]和芴甲氧羰酰氯[14]等衍生劑對其進行衍生，以增強其在紫外或熒光檢測器上的信號響應(yīng)。葡萄酒中含有多種游離氨基酸，其同樣會與上述衍生劑反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量潛在干擾液相色譜分離的新色譜峰。為了降低干擾，衍生后的樣品在進行液相色譜分析之前通常還需要進行進一步的凈化處理，這延長了分析時間，增加了方法的復(fù)雜性[12-13]。氣相色譜-電子捕獲檢測器（gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD）分析具有高靈敏度，并且對電負(fù)性物質(zhì)（特別是含鹵族元素的有機物）具有高選擇性，但將其用于發(fā)酵食品中生物胺分析的研究還未見報道。

本研究建立了氣相色譜-電子捕獲檢測器分析葡萄酒中生物胺的方法。該方法對葡萄酒中的生物胺同時進行了提取和衍生，對生物胺提取和衍生溶劑的種類、衍生劑用量、催化劑種類及添加量條件進行優(yōu)化，并采用GC-ECD對生物胺進行分析，以期使葡萄酒中生物胺的分析更加簡便易行，為含有復(fù)雜基質(zhì)的液態(tài)發(fā)酵食品中生物胺的分析提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅葡萄酒：中國、澳大利亞品牌各2個；從每個品牌葡萄酒中取樣100 mL，振蕩混合，作為測試樣品，于4 ℃冷藏待用。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、酪胺、β-苯乙胺、組胺和色胺的鹽酸鹽、氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯、吡啶、三乙胺（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷（均為色譜純）：美國TEDIA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC2014氣相色譜儀：日本島津公司；Vortex-Genie2漩渦混合器：美國Scientific Industries公司；N-EVAP-34氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單標(biāo)儲備液的配制：將上述8種生物胺的鹽酸鹽分別溶解在超純水中，配成終濃度為4 mmol/L的單標(biāo)溶液。

混標(biāo)儲備液的配制：從每種單標(biāo)溶液中吸取10 mL溶液，加入至100 mL容量瓶中，用超純水定容，即配成單標(biāo)濃度為0.4 mmol/L的混標(biāo)儲備液。

混標(biāo)工作溶液的配制：用超純水按比例依次稀釋混標(biāo)儲備液，即制備成單標(biāo)濃度分別為200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、10 μmol/L、5 μmol/L和1 μmol/L的生物胺混標(biāo)工作溶液。

1.3.2 生物胺提取衍生條件及其優(yōu)化

提取衍生條件：取0.5 mL混標(biāo)工作溶液或葡萄酒樣品，加入5 mL玻璃具塞試管內(nèi)，再加入0.5 mL 0.2 mol/L碳酸鈉溶液將pH調(diào)至約11.8（將有機相中的離子態(tài)生物胺轉(zhuǎn)化為質(zhì)子態(tài)，促進其向有機相中轉(zhuǎn)移），隨后加入4 mL二氯甲烷（作為生物胺的提取溶劑和衍生反應(yīng)的有機相）、20 μL氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯（作為生物胺的衍生劑）和10 μL的三乙胺（作為衍生反應(yīng)的催化劑），旋渦混勻，于40 ℃反應(yīng)10 min，吸取1 mL有機相進行氣相色譜分析。

提取衍生條件的優(yōu)化：分別考察有機溶劑種類（二氯甲烷、乙酸乙酯）、衍生劑添加量（10 μL、20 μL、30 μL）、催化劑的種類（吡啶、三乙胺）以及催化劑添加量（5 μL、10 μL、15 μL）對衍生產(chǎn)物生成的影響，以確定最佳的衍生條件。

1.3.3 氣相色譜分析

氣相色譜條件：進樣口溫度280 ℃，進樣體積為1 μL；分流比10∶1；色譜柱：HP-5非極性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱流量1.8 mL/min；程序升溫為初始溫度120 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至270 ℃，保持1 min；電子捕獲檢測器，溫度300 ℃，尾吹氣為氮氣（N2），N2流量30 mL/min。

定性、定量分析：根據(jù)保留時間對特定生物胺的衍生物進行定性分析。采用峰面積外標(biāo)法對樣品中的生物胺進行定量分析。設(shè)對照組的峰面積為100%，試驗組峰面積與其比值為試驗組的相對峰面積。

1.3.4 方法學(xué)評價

靈敏度試驗：將生物胺混標(biāo)溶液依次進行2倍稀釋，然后進行色譜分析，選取峰高約為基線噪音10倍的色譜峰，計算信噪比。依據(jù)信噪比3和10分別計算目標(biāo)物的檢出限（limitofdetection，LOD）和定量限（limitofquantitation，LOQ）。

加標(biāo)回收率試驗：分別向已知含量的同一葡萄酒樣品中添加1 mol/L、10 mol/L和100 mol/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2和1.3.3的方法進行衍生和氣相色譜分析，計算各成分的加標(biāo)回收率。

精密度試驗：取葡萄酒混合樣品，配制8組不同質(zhì)量濃度的生物胺溶液，每組濃度分別做6個平行樣，按照1.3.2和1.3.3的方法進行衍生和氣相色譜分析，記錄峰面積，每個樣品平行測定3次，取3次測定結(jié)果的平均值，并計算精密度試驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，使用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用一維方差分析進行組間差異性分析，多重比較選用Duncan法。P＜0.05認(rèn)為組間存在差異性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的氣相色譜圖

8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的氣相色譜圖見圖1。由圖1可知，8種生物胺的衍生物在HP-5毛細(xì)管色譜柱上可以很好地分離，保留時間由低至高依次為β-苯乙胺、組胺、亞精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺和精胺的衍生物。各種生物胺衍生物彼此間都實現(xiàn)了基線分離。由于生物胺的極性基團（伯胺基或仲胺基）在衍生反應(yīng)后被封閉，因此衍生物相對于前體物具有更低極性，這保證了其在非極性毛細(xì)管色譜柱上能呈現(xiàn)出尖銳對稱、無明顯前沿和拖尾的色譜峰形，為目標(biāo)物色譜峰的分離和準(zhǔn)確定量提供了技術(shù)保障。

圖1 8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of derivatives of biogenic amine mixed standards

由于精胺有4個胺基與衍生劑發(fā)生了酰胺化反應(yīng)，這致使衍生物的分子質(zhì)量和沸點遠(yuǎn)高于前體物精胺，極性也遠(yuǎn)低于精胺，因而其在非極性毛細(xì)管色譜柱上的保留時間也更長。β-苯乙胺只含有1個伯胺基，其對應(yīng)的衍生產(chǎn)物的分子質(zhì)量和沸點較低、極性較大，故而其保留時間最短。

2.2 生物胺衍生條件的優(yōu)化

2.2.1 衍生劑添加量

氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯在有機合成過程中常被用作胺基基團的保護試劑[14]，在分析化學(xué)領(lǐng)域用于氣相色譜法或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析麻黃堿和苯丙胺類藥物[15-16]。為了使衍生反應(yīng)能夠進行得更徹底，通常衍生劑的用量都應(yīng)該在理論用量的10倍以上。衍生劑添加量對生物胺衍生物相對峰面積的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)5 mL體系中衍生劑添加量為10～30 μL時，β-苯乙胺、腐胺、尸胺衍生物的相對峰面積差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)衍生劑添加量為10～20 μL時，組胺、亞精胺、色胺、酪胺和精胺的相對峰面積顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)衍生劑添加量為20 μL時，β-苯乙胺、組胺、亞精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相對峰面積分別為98.5%、98.2%、115.1%、113.3%、98.2%、110.1%、122.2%和130.2%；當(dāng)衍生劑添加量為20～30 μL，相對峰面積變化不顯著（P＞0.05）。由此可見，20 μL的衍生劑添加量已經(jīng)能夠保證衍生反應(yīng)進行至最大化，因此5 mL體系中最優(yōu)的衍生劑添加量為20 μL。

圖2 衍生劑用量對生物胺衍生物相對峰面積的影響Fig.2 Effect of derivative addition on relative peak area of biogenic amine derivatives

2.2.2 催化劑類型及添加量

由于吡啶和三乙胺是酰胺化反應(yīng)過程中常用的縛酸劑和催化劑[17-18]，吡啶和三乙胺因其氮原子上含有未共用電子對可接受質(zhì)子而顯堿性。吡啶的共軛酸的pKa數(shù)值約為5.2，而三乙胺的pKa數(shù)值則約為10.7[19]，由此可見，三乙胺的堿性更強。催化劑種類及添加量對生物胺衍生物生成的影響見圖3。

圖3 催化劑種類和添加量對生物胺衍生物相對峰面積的影響Fig.3 Effect of catalyst type and addition on relative peak area of biogenic amine derivatives

由圖3可知，當(dāng)催化劑為吡啶時，5 mL體系中吡啶添加量為5～15 μL時，β-苯乙胺、組胺、亞精胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相對峰面積差異不顯著（P＞0.05）。吡啶添加量為5～10 μL時，色胺衍生物的相對峰面積逐漸增加；吡啶添加量為10 μL時，色胺衍生物的相對峰面積達(dá)到最大值；吡啶添加量為10～15 μL時，色胺衍生物的相對峰面積逐漸下降。吡啶添加量為10 μL時，β-苯乙胺、組胺、亞精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相對峰面積分別是對照組的1.02、1.60、0.98、2.22、1.10、1.02、0.94和1.08倍。因此，吡啶最佳添加量為10 μL。

當(dāng)催化劑為三乙胺時，添加量為5～15 μL時，β-苯乙胺、亞精胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺的衍生物相對峰面積差異不顯著（P＞0.05）。吡啶添加量為5～10 μL時，組胺、色胺衍生物的相對峰面積逐漸增加；吡啶添加量為10 μL時，組胺、色胺衍生物的相對峰面積達(dá)到最大值；三乙胺添加量為10～15 μL時，色胺衍生物的相對峰面積逐漸下降三乙胺添加量為10 μL時，β-苯乙胺、組胺、亞精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相對峰面積分別是對照組的1.74、12.00、1.48、15.22、1.85、2.46、1.48和1.85倍。綜合考慮，三乙胺為最佳催化劑，最優(yōu)添加量為10 μL。

2.2.3 提取和衍生溶劑有機相

乙酸乙酯已經(jīng)用于酒類產(chǎn)品中生物胺的提取，并且對其中的生物胺起到了較好的提取效果[20-21]，此外，二氯甲烷也已用于醬油[22]和中藥提取液[23-24]中生物胺的提取，同樣顯示了較高的提取率。二氯甲烷對生物胺衍生物相對峰面積的影響見圖4。

圖4 二氯甲烷和乙酸乙酯對生物胺衍生物相對峰面積的影響Fig.4 Effect of methylene dichloride and ethyl acetate on relative peak area of biogenic amine derivatives

由圖4可知，二氯甲烷比乙酸乙酯更適合作為生物胺的提取和衍生溶劑有機相。使用二氯甲烷作為溶劑時，β-苯乙胺、組胺、亞精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺衍生物的相對峰面積分別是乙酸乙酯作為溶劑時的8.0、12.1、4.8、11.2、3.6、5.0、10.3和4.2倍。由此可見，在促進芳香族生物胺（β-苯乙胺和酪胺）和雜環(huán)生物胺（組胺和色胺）衍生物產(chǎn)生方面，二氯甲烷的作用更為突出。因此，選擇二氯甲烷為最佳提取和衍生溶劑有機相。

綜上所述，試驗確定的衍生劑（氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯）添加量為20 μL；最佳催化劑為三乙胺，添加量為10 μL；最佳提取和衍生溶劑有機相為二氯甲烷。碳酸鈉溶液堿化樣品溶液，促進了水相中生物胺的質(zhì)子化，從而使其更容易脫離水相而進入有機相。在有機相中，生物胺與衍生劑發(fā)生了酰胺化反應(yīng)，從而導(dǎo)致有機相中生物胺濃度不斷下降，這會導(dǎo)致水相中的生物胺持續(xù)進入有機相而被衍生，該過程循環(huán)往復(fù)，使同時提取和衍生生物胺變成可能。氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯是一類活潑的胺基衍生劑，即便在室溫條件下，其也可以與胺基化合物迅速反應(yīng)[25]。衍生試劑與有機物的伯胺基和仲胺基均能反應(yīng)，且反應(yīng)過程迅速，反應(yīng)條件溫和，通常在室溫下反應(yīng)10 min即可達(dá)到最大產(chǎn)率[26]。這是因為水相中的質(zhì)子化的生物胺向有機相轉(zhuǎn)移需要時間。乙酸乙酯和二氯甲烷作為酰胺化衍生反應(yīng)的溶劑時，在衍生物產(chǎn)量上的差異應(yīng)該與酰鹵和生物胺發(fā)生縮合反應(yīng)的特性有關(guān)[27]。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性關(guān)系試驗考察

電子捕獲檢測器是靈敏度最高的氣相色譜檢測器，同時又是最早出現(xiàn)的選擇性色譜檢測器。它僅對那些能捕獲電子的化合物，如鹵代物、含N、O和S等雜原子的化合物有響應(yīng)，特別是對含鹵族元素的化合物有極高響應(yīng)[28]。8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限見表1。

表1 8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Standard curve regression equation,linear range,limit of detection,and limit of quantification of 8 kinds of biogenic amines

由表1可知，8種生物胺的檢出限在0.2～0.8 μmol/L之間，定量限在0.7～2.0 μmol/L之間。在分析的8種生物胺中，組胺的檢出限最高，而β-苯乙胺的檢出限最低。8種生物胺在其定量限濃度～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)均顯示了良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.998 0。在本研究分析的8種生物胺中，任何一種生物胺只要它的一個胺基與衍生試劑發(fā)生?；磻?yīng)就可獲得3個Cl原子，導(dǎo)致生物胺衍生物在電子捕獲檢測器上具有極低的檢出限。

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗

按照1.3.4的方法測定各成分的加標(biāo)回收率，試驗結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of standard recovery tests

由表2可知，當(dāng)生物胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在葡萄酒樣品中的添加濃度為1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L時，8種生物胺的加標(biāo)回收率范圍分別為91.2%～98.2%、94.4%～102.1%和96.6%～101.4%。在任一加標(biāo)濃度下任意一種生物胺的回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，說明方法具有較高的回收率，即方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.3.3 精密度試驗

按照1.3.4的方法測定各成分的含量并計算精密度試驗RSD，結(jié)果見表3。

由表3可知，葡萄酒樣品的精密度試驗結(jié)果RSD為1.8%～3.3%。β-苯乙胺的精密度試驗結(jié)果RSD最低，為1.8%，而酪胺的精密度試驗結(jié)果RSD最高，為3.3%，每種生物胺的精密度試驗結(jié)果RSD均＜4%，表明本方法具有較高的精密度。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.3.4 實際樣品測定結(jié)果

采用本研究建立的方法對2個國內(nèi)品牌和2個國外品牌的葡萄酒樣品生物胺含量進行了檢測，其結(jié)果見表4。

表4 市售葡萄酒樣品中生物胺的含量Table 4 Contents of biogenic amines in commercial wine samples

由表4可知，同一種生物胺含量在不同品牌的葡萄酒中差異較大。從總體上看，腐胺和酪胺的含量較高（84.5～114.2 μmol/L），而亞精胺（0.0～0.9 μmol/L）和精胺（均未檢出）的含量較低。對于毒性較強的組胺來說，其在不同品牌的葡萄酒中的含量也存在較大差異（14.3～32.1 μmol/L）。其在國產(chǎn)品牌2中的含量最高，達(dá)到了32.1 μmol/L，在國產(chǎn)品牌1中的含量最低，為14.3 μmol/L，前者是后者的2.2倍。此外，在國產(chǎn)品牌2和進口品牌1的葡萄酒中，組胺含量均＞2 mg/L，存在潛在風(fēng)險。

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-電子捕獲檢測法分析葡萄酒樣品中8種生物胺的技術(shù)，將葡萄酒樣品中的生物胺進行提取衍生，采用GC-ECD進行檢測，外標(biāo)法定量。8種生物胺的LOD為0.2～0.8 μmol/L，LOQ為0.7～2.0 μmol/L，平均加標(biāo)回收率為91.2%～102.1%，精密度試驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.8%～3.3%，該方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。該技術(shù)將生物胺提取和衍生合并在一起同步進行，縮短了分析時間，簡化了分析步驟，并且由于衍生反應(yīng)在有機相中進行，因而避免了游離氨基酸進入有機相而被衍生，從而降低了衍生產(chǎn)物色譜峰的復(fù)雜性，并且電子捕獲檢測器對電負(fù)性物質(zhì)具有高選擇性，使葡萄酒中生物胺的分析更加簡便易行，為含有復(fù)雜基質(zhì)的液態(tài)發(fā)酵食品中生物胺的分析提供了解決方案。