真皮干細(xì)胞SKPs對銀屑病樣小鼠模型治療作用分析

陳小鳳，許鳳麗，熊霞，鐘建橋

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性疾病，嚴(yán)重影響患者身心健康[1-2]。目前該病確切病因病機尚未完全闡明，但研究認(rèn)為免疫炎癥和氧化應(yīng)激在銀屑病的發(fā)病中起著重要促進作用[3-4]?，F(xiàn)今針對銀屑病的治療藥物很多，但因其不良反應(yīng)多、長期療效不確切、費用昂貴等而受限制[5]。皮膚源性前體細(xì)胞(skin-derived precursors，SKPs)是真皮來源的干細(xì)胞，具有抗炎、抗氧化、促進創(chuàng)傷組織修復(fù)等作用，已用于炎癥性、創(chuàng)傷性、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病等多種疾病的治療[6-7]，但關(guān)于其在銀屑病方面的研究至今尚未見報道。故為探索SKPs對銀屑病的治療作用，本實驗通過構(gòu)建銀屑病樣動物模型，經(jīng)SKPs干預(yù)后，觀察其相關(guān)指標(biāo)的變化，進一步為SKPs治療銀屑病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 BALB/c雄性無毛小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證編號：SCXK(川)2015-030]，為4周大小，體重約16～18 g。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)城北動物實驗中心SPF級實驗室，使用消毒墊料、酸化水及無菌飼料，室內(nèi)溫度為18 ℃～24 ℃、濕度為40%～70%，采光為12 h明暗交替。本研究已通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20220704-005)。

1.1.2實驗細(xì)胞 SKPs取材于新生1～3 d的BALB/c雄性乳鼠真皮(購自成都達碩實驗動物有限公司)。

1.1.3主要試劑 咪喹莫特乳膏(imiquimod，IMQ)(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒(南京建成科技有限公司)；ROS、IL-17、IL-23試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1SKPs體外分離培養(yǎng)與鑒定 參照課題組前期的實驗方法[8-9]，取新生1～3 d的BALB/c乳鼠，用碘伏浸泡處死乳鼠，75%酒精反復(fù)脫碘、消毒、PBS沖洗后，取背部皮膚去除皮下脂肪、血管，用眼科剪將皮膚剪成0.5 cm2大小，加入0.25%的胰酶(美國Gibco Life Technologies)，放入37 ℃、5% CO2孵箱中消化30 min后，分離表皮和真皮，棄表皮。將真皮反復(fù)剪碎、吹打、靜置，吸取上清液過濾、離心后棄去上清液，加入含20 ng/mL表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、40 ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、2% B27的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長情況并換液，直至細(xì)胞生長成熟以備用。本實驗組在前期研究中已對該細(xì)胞進行鑒定[7]，已證實為SKPs。

1.2.2銀屑病樣鼠模型的構(gòu)建與分組 于小鼠背部皮膚涂抹5%的IMQ乳膏62.5 mg/d，面積約3 cm×4 cm，1次/d，連續(xù)涂抹6 d，以構(gòu)建銀屑病樣小鼠模型。同時以凡士林為對照，方法同上述。小鼠皮膚出現(xiàn)銀屑病典型皮損和病理改變，則提示造模成功。將20只小鼠隨機分成4組(每組5只)，即模型組(僅外用IMQ)、治療組(外用IMQ+皮內(nèi)注射SKPs)、對照組(外用IMQ+皮內(nèi)注射培養(yǎng)基)和凡士林組(僅外用凡士林)。

1.2.3SKPs干預(yù)銀屑病樣鼠模型 按上述模型構(gòu)建方法對前三組即模型組、治療組和對照組小鼠背部皮膚外涂IMQ乳膏，凡士林組外涂凡士林乳膏。在涂抹IMQ第1天，將1.2.1部分培養(yǎng)的SKPs用Hanks液重懸制成濃度1×104個/100 μL的細(xì)胞懸液，取100 μL SKPs懸液分6點皮內(nèi)注射(即背部皮膚的中央部位注射1點，周圍皮膚分別均勻注射5點)到治療組小鼠背部皮膚(僅第1天注射)，隨后再連續(xù)涂抹IMQ 5 d；對照組在首次涂抹IMQ后，將100 μL Hanks液同前方法注射到小鼠背部皮膚，然后繼續(xù)涂抹IMQ 5 d。模型組和凡士林組僅分別涂抹IMQ或凡士林共6 d。肉眼觀察皮損變化，采用銀屑病面積與嚴(yán)重指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)對皮損評分；第7天，稱重后處死小鼠，分離小鼠脾臟稱重后計算脾臟體重指數(shù)(splenic index，SI)；收集小鼠血液及背部皮膚進行相關(guān)實驗室指標(biāo)檢測。

1.2.4PASI評分與SI計算 肉眼觀察小鼠背部皮膚紅斑、鱗屑、浸潤情況，行PASI評分，分別為0～4分(0分=無；1分=輕度；2分=中度；3分=重度；4分=極重度)。每天觀察并拍照，將三者得分相加為PASI總分(0～12分)，各組小鼠皮損積分取平均值。處死小鼠前稱其體重，處死后取脾臟觀察脾臟大小并稱重，計算SI，SI=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.2.5病理組織學(xué)檢測 取小鼠背部皮膚行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。即將各組皮膚組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后，放于循環(huán)機中脫水、浸蠟12 h，然后進行石蠟包埋、切片、HE染色、中性樹脂封片，最后置于顯微鏡下觀察各組皮膚病理組織學(xué)變化。

1.2.6炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束后取各組小鼠全血分離獲得血清。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中SOD、GSH、MDA、ROS、CAT、IL-17、IL-23等炎癥因子和相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的蛋白表達水平。具體操作步驟按說明書進行，最后在酶標(biāo)儀不同波長處讀出吸光度OD值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測指標(biāo)值。

1.2.7實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR) 將各組小鼠背部皮膚組織分別研碎，采用Trizol提取皮膚組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶體系將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后將制備好的cDNA在擴增體系下進行PCR擴增，檢測基因MAPK、NF-κB、SOD、GSH、iNOS、ROS、CAT、IL-17、IL-23的引物序列見表1。以GAPDH基因作內(nèi)參，應(yīng)用F=2-△△Ct進行相對定量分析。

表1 各基因引物序列Tab.1 The primer sequences of the genes

2 結(jié)果

2.1SKPs的形態(tài)及特征 原代培養(yǎng)的SKPs在培養(yǎng)基中呈懸浮生長，外觀表現(xiàn)為橢圓形或圓形、大小不一的克隆樣細(xì)胞球，其邊緣明亮，而中央略暗(圖1)。

×100；×400圖1 SKPs原代培養(yǎng)Fig.1 Primary culture of SKPs

2.2SKPs改善銀屑病樣鼠外觀和降低PASI評分 模型組小鼠背部皮膚浸潤明顯，可見紅斑、斑塊及大量厚層鱗屑，隨著造模時間延長，皮損逐漸加重，PASI評分逐漸升高，于第7天達高峰，總分為11分(圖2a，圖3)；但經(jīng)SKPs干預(yù)后，治療組隨著時間延長，皮損較模型組及對照組明顯減輕，僅見片狀紅斑和少許鱗屑，輕度浸潤，PASI評分總分為5分(圖2b，圖3)；對照組皮膚表現(xiàn)與模型組相似，PASI評分總分為10.8分(圖2c，圖3)；凡士林干預(yù)后其皮膚外觀同正常小鼠，皮膚光滑，無紅斑、鱗屑、浸潤等，PASI評分為0分(圖2d，圖3)。

Model group；Treatment group；Control group；Vaseline group圖2 各組小鼠皮膚外觀表現(xiàn)Fig.2 Skin appearance of mice in different groups

圖3 隨著時間的變化各組小鼠皮膚的PASI評分Fig.3 The PASI score of mice in different groups along with time variation

2.3SKPs減輕組織病理學(xué)表現(xiàn) 模型組小鼠經(jīng)IMQ干預(yù)后其皮膚在病理上表現(xiàn)為角化過度、角化不全、角質(zhì)層、棘層明顯增厚，顆粒層變薄或減少、表皮突下移，真皮可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖4a)。但經(jīng)SKPs移植后，治療組鏡下表皮僅輕度角化過度，未見角化不全，角質(zhì)層及棘層厚度明顯減少，顆粒層細(xì)胞增多，真皮層僅見少許炎癥細(xì)胞浸潤(圖4b)；對照組病理組織學(xué)表現(xiàn)與模型組相似(圖4c)；凡士林組則表現(xiàn)為皮膚組織結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，角質(zhì)層和棘層無增厚，顆粒層無減少，真皮層未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(圖4d)。

Model group；Treatment group；Control group；Vaseline group圖4 各組小鼠組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE×100)Fig.4 Histopathological manifestations of mice in each group (HE×100)

2.4SKPs減輕脾臟腫大和降低SI 模型組脾臟增大明顯，SI較凡士林組明顯升高(P<0.05)；而經(jīng)SKPs注射后，其脾臟縮小，SI較模型組及對照組顯著降低(P<0.05)；對照組脾臟大小與模型組相似，SI與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而凡士林組脾臟無增大(圖5)。

Note:Compared with the vaseline group，*P<0.05；compared with the model group，&P<0.05；compared with the control group，#P<0.05.圖5 各組SI變化Fig.5 Alterations of SI in different groups

2.5SKPs調(diào)節(jié)炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平 經(jīng)IMQ涂抹后，模型組血清中MDA、ROS及炎癥因子IL-17、IL-23水平均較凡士林組升高，而SOD、GSH和CAT等抗氧化物水平下降(P<0.05)；但經(jīng)SKPs注射后，治療組血清中MDA、ROS、IL-17、IL-23表達水平顯著下調(diào)，SOD、GSH、CAT表達水平顯著升高，較模型組和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

Note:Compared with the vaseline group，*P<0.05；compared with the model group，&P<0.05；compared with the control group，#P<0.05.圖6 各組炎癥因子及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達水平Fig.6 Protein expression levels of inflammatory/oxidative stress-related indicators in different groups

2.6SKPs調(diào)節(jié)炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的基因表達 模型組表達MAPK、NF-κB、iNOS、ROS、IL-17、

IL-23的mRNA水平較凡士林組明顯升高，而SOD、GSH、CAT的mRNA水平較凡士林組下降(P<0.05)。但經(jīng)SKPs干預(yù)后，治療組MAPK、NF-κB、iNOS、ROS、IL-17、IL-23的mRNA表達水平明顯降低，SOD、GSH、CAT的mRNA水平顯著升高，與模型組和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而，對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

Note:Compared with the vaseline group，*P<0.05；compared with the model group，&P<0.05；compared with the control group，#P<0.05Inflammatory related genes；Oxidative stress-related genes圖7 各組炎癥因子及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的基因表達Fig.7 Relative expression of inflammatory/oxidative stress-related genes in different groups

3 討論

銀屑病是一種慢性、炎癥性疾病，可能與遺傳、免疫、環(huán)境、感染等因素相關(guān)[10]。而免疫炎癥和氧化應(yīng)激在銀屑病的發(fā)病中起著關(guān)鍵促進作用。研究表明，炎癥相關(guān)因子IL-17、IL-23和TNF-α等在銀屑病中明顯升高[11]；同時iNOS和ROS等氧化物生成增多，而抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH等活性下調(diào)，激發(fā)氧化應(yīng)激，進一步激活MAPK、NF-κB等信號通路，產(chǎn)生一系列炎癥因子如IL-17、IL-23和TNF-α等，進而促進角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖及真皮炎癥細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展[12-13]。近年來干細(xì)胞因具有抗炎、抗氧化、促進組織修復(fù)等作用而日益?zhèn)涫荜P(guān)注。而真皮干細(xì)胞SKPs通過上調(diào)抗氧化物活性和下調(diào)氧化產(chǎn)物的表達，從而在多種疾病中發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[14-15]。

因此，本研究為觀察SKPs對銀屑病的療效，首先進行了銀屑病樣動物模型的構(gòu)建。目前關(guān)于銀屑病動物模型的構(gòu)建方法較多，其中IMQ直接誘導(dǎo)法是十分常用的造模方法，已廣泛用于銀屑病的臨床前研究[16-17]，故本實驗采用了局部涂抹IMQ建立銀屑病樣小鼠模型。筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IMQ干預(yù)后小鼠背部皮膚出現(xiàn)典型的厚層鱗屑覆蓋的紅斑/斑塊；PASI評分逐漸增加，于第7天達高峰；組織病理學(xué)出現(xiàn)角化過度/角化不全、棘層明顯增厚、顆粒層變薄或減少，真皮炎癥細(xì)胞浸潤等。其小鼠皮膚外觀和病理表現(xiàn)類似人銀屑病表現(xiàn)。同時隨著IMQ的干預(yù)，SI、炎癥因子及氧化物水平升高，而抗氧化物活性降低，表明IMQ的應(yīng)用不僅促使銀屑病樣癥狀出現(xiàn)，而且能引起炎癥反應(yīng)和氧化發(fā)生，這些變化與既往文獻報道的一致[18-19]。因此，證實了本研究已成功構(gòu)建出銀屑病樣小鼠模型，并處于炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)，與銀屑病的發(fā)病機制吻合。

在成功建立銀屑病樣模型鼠的基礎(chǔ)上，筆者予以了SKPs進行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SKPs局部移植可明顯減輕銀屑病樣癥狀和組織病理學(xué)改變、降低PASI評分，而對照組Hanks液則無此作用；表明SKPs對銀屑病樣鼠具有較好的治療效果。同時SKPs可顯著降低銀屑病樣模型鼠的炎癥因子IL-17、IL-23和氧化物MDA、ROS的蛋白基因水平，促進抗氧化物SOD、GSH等表達。提示SKPs治療實驗性銀屑病可能是通過抑制炎癥和拮抗氧化應(yīng)激而作用，這尤其與SKPs抗炎和抗氧化的活性密切相關(guān)。該結(jié)果與課題組前期研究以及其他學(xué)者報道相符[15，20]。他們通過實驗發(fā)現(xiàn)SKPs能顯著上調(diào)光損傷模型鼠SOD、GSH等表達，降低ROS、MDA等水平；抑制炎癥環(huán)境中IL-17分泌型T細(xì)胞的生成和促進調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活化，進而起到抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用。

在初步證實了SKPs通過抗炎、抗氧化而對銀屑病具有治療作用，但機制又是如何呢？既往研究表明，銀屑病中多條信號通路異常激活，主要涉及MAPK和NF-κB等；MAPK和NF-κB信號的激活促進了銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化以及炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子(IL-17、TNF-α等)的分泌，進而加速了銀屑病的發(fā)生與發(fā)展[21-22]。因此，為進一步探討SKPs抗銀屑病的可能機制，筆者又對MAPK、NF-κB等基因進行檢測。結(jié)果顯示，IMQ外涂后模型組中MAPK、NF-κB及iNOS、ROS、IL-17、IL-23的mRNA水平升高，而SOD、GSH、CAT基因水平下降；但經(jīng)SKPs干預(yù)后，MAPK、NF-κB及iNOS、ROS、IL-17、IL-23基因表達下調(diào)，SOD、GSH、CAT基因水平上調(diào)，而對照組較模型組無明顯變化。說明SKPs可從基因水平調(diào)節(jié)炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)的轉(zhuǎn)錄和表達，從而發(fā)揮其抗炎、抗氧化能力，最終實現(xiàn)抗實驗性銀屑病的作用。這可能與SKPs抑制MAPK、NF-κB兩條關(guān)鍵途徑及其下游信號，進而抗炎和抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，本研究通過IMQ構(gòu)建銀屑病樣鼠模型，予以SKPs進行干預(yù)，從皮膚外觀、組織病理、SI、炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的蛋白和基因水平上初步探索了SKPs對實驗性銀屑病的治療作用，這為銀屑病的治療提供了新的方向，但其具體治療機制有待在將來的體外實驗中進一步闡明。