數(shù)字PCR在腫瘤無創(chuàng)診療中的應(yīng)用進(jìn)展*

林金端，劉紅偉，馮子人，張慧賢 綜述，尹衛(wèi)國 審校

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院分子診斷中心，廣東清遠(yuǎn) 511500

1999年，VOGELSTEIN創(chuàng)造了“數(shù)字PCR”一詞，文章正式報道于美國科學(xué)院院報，并表明該技術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)罕見的癌癥突變[1]。數(shù)字PCR(dPCR)是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，通過將一個樣本分配到幾十至幾十萬個反應(yīng)單元，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并收集熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。相較于傳統(tǒng)PCR， dPCR的優(yōu)勢主要在于：(1)絕對定量，該技術(shù)結(jié)果判定不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(Ct)，不受擴(kuò)增效率的影響，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。(2)樣品需求量低，在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優(yōu)勢。(3)高靈敏度，dPCR本質(zhì)上是將一個傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分成了數(shù)萬個獨(dú)立的PCR反應(yīng)，在這些反應(yīng)中可以精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質(zhì)雙鏈的形成。(4)高耐受性，由于目的序列被分配到多個微滴中，顯著降低了體系間的影響及背景序列和抑制物對反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小。因此 dPCR適用于不能依靠Ct值很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。在豐度低、樣本珍貴、背景復(fù)雜的腫瘤樣本檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

盡管近年來腫瘤診療已取得了許多進(jìn)展，但腫瘤仍然是全世界死亡的主要原因之一。基因分子分型檢測促進(jìn)腫瘤個體化治療，顯著改善了治療效果。目前分子分型主要依賴于手術(shù)或活檢組織進(jìn)行PCR、免疫組織化學(xué) (IHC) 和熒光原位雜交檢測 (FISH)等方法。然而，對于早期或部分晚期腫瘤患者，難以獲得足夠組織樣本進(jìn)行檢測或因各種原因無法實施活檢，此時進(jìn)行血液檢測具有重要意義。在腫瘤晚期，凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液時會釋放產(chǎn)生外周血游離 DNA(cfDNA)，cfDNA 在血漿中水平較低，片段很短，因此，使用血漿樣本進(jìn)行突變基因檢測時如何提高檢測方法靈敏度至關(guān)重要。當(dāng)前靈敏度較高的檢測方法主要包括突變擴(kuò)增系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)、dPCR和二代測序(NGS)等。

dPCR作為第三代PCR技術(shù)，與ARMS-PCR和NGS比較，具有靈敏度高、操作流程簡單、受背景信號干擾小等優(yōu)點(diǎn)。近年來，dPCR技術(shù)在腫瘤無創(chuàng)診療領(lǐng)域已開始展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。本文將通過分析dPCR在常見腫瘤中的應(yīng)用情況探索dPCR液體活檢技術(shù)在大多數(shù)腫瘤診療中的實際臨床應(yīng)用效果。

1 dPCR技術(shù)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的無創(chuàng)診療

NSCLC是最常見的肺癌類型，占所有肺癌的80%～85%。目前可用于指導(dǎo)臨床靶向藥物選擇的驅(qū)動基因包括表皮生長因子(EGFR)、V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、人表皮生長因子受體 2 (HER2)、克氏大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)和間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子，以及間變性淋巴瘤激酶(ALK)、v-ros UR2 肉瘤病毒癌基因同源物1、原癌基因酪氨酸蛋白激酶受體和神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1/2重排等。

1.1dPCR技術(shù)在EGFR突變NSCLC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 EGFR是NSCLC中最常見的突變基因，占10%～35%。其突變類型以21號外顯子L858R 和 L861Q 及19號外顯子缺失最為常見，約占所有EGFR突變的85%。EGFR突變患者對酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 敏感。多重 dPCR進(jìn)行血漿EGFR突變檢測可顯著提高其檢出率，使更多患者有機(jī)會使用TKI，改善預(yù)后[2]。近期LEE等[3]基于75例早期和晚期NSCLC患者的86份血漿樣本進(jìn)行血漿與組織EGFR突變的檢測，并將檢出率進(jìn)行比較，利用dPCR檢測血漿EGFR突變，其檢出率接近組織EGFR突變率(43.2%vs.52.3%)。

除用于驅(qū)動基因檢測外，dPCR在NSCLC診療中的另一個重要應(yīng)用方向是耐藥監(jiān)測。通過 dPCR 檢測T790M突變已經(jīng)成為EGFR突變NSCLC患者使用TKI藥物后耐藥監(jiān)測的重要手段。SPENCE等[4]利用 dPCR技術(shù)檢測343例NSCLC 患者血漿中的EGFR突變，發(fā)現(xiàn)24% 的患者中存在EGFR T790M突變，血漿EGFR T790M突變可有效預(yù)測奧希替尼療效，避免患者接受侵入性組織活檢。LI等[5]通過回顧性分析dPCR技術(shù)檢測奧希替尼二線治療后部分反應(yīng)、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展期的患者血漿cfDNA中的T790M突變頻率，發(fā)現(xiàn)奧希替尼二線治療部分反應(yīng)、疾病穩(wěn)定患者血漿中T790M突變水平高于疾病進(jìn)展期的患者，且血漿中T790M突變水平與患者無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)相關(guān)，但BUDER等[6]卻提出NSCLC患者血漿中T790M水平與患者預(yù)后未存在明顯關(guān)系。因此，目前仍需更多的研究和標(biāo)準(zhǔn)來評估dPCR技術(shù)用于血漿T790M 突變的定量是否可用于預(yù)測患者TKI治療反應(yīng)。

除T790M突變外，EGFR基因的C797S突變也是NSCLC患者奧希替尼耐藥的主要原因。有20%～40%的奧希替尼耐藥是由C797S 突變引起的，通過dPCR，縱向評估治療前后血漿 EGFR T790M和 C797S 水平，顯示血漿 cfDNA不同EGFR突變類型可作為評價奧希替尼治療期間疾病進(jìn)展的預(yù)后因素，這可能有助于臨床決策的制訂[7]。目前，dPCR 技術(shù)還用于檢測晚期 NSCLC 患者中EGFR基因不太常見的突變，例如 G719S 和 L851Q[8]。此外dPCR檢測EGFR突變已開始在支氣管沖洗液、細(xì)針抽吸上清液、痰液和尿液等其他體液樣本中進(jìn)行探索。有研究表明，對于發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的肺癌患者，也可通過檢測腦脊液中的EGFR突變來評估患者預(yù)后，其預(yù)測效果優(yōu)于血漿樣本[9]。

1.2dPCR技術(shù)在KRAS突變NSCLC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 KRAS是一種致癌驅(qū)動基因，25%～30%的NSCLC患者中存在KRAS突變[10]。盡管針對其突變的多種靶向藥物對患者臨床結(jié)果的影響已得到證實，但目前只有索托拉西布獲得美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于KRAS G12C NSCLC 患者[11]。目前已有多重dPCR技術(shù)可用于檢測KRAS基因最常見的 G12/G13突變的，實現(xiàn)對血漿 cfDNA 進(jìn)行靈敏、快速、準(zhǔn)確的基因分型，其檢出限至少可達(dá)0.2%，幫助臨床醫(yī)生快速判斷患者是否適合使用索托拉西布[11-12]。另外，dPCR技術(shù)也用于NSCLC KRAS突變患者預(yù)后判斷，目前已觀察到NSCLC患者血漿KRAS突變水平隨著疾病進(jìn)展而增加，Ⅰ期8%，Ⅱ期30%，Ⅲ期71%，Ⅳ期73%[12]。此外，一項基于dPCR技術(shù)的研究已發(fā)現(xiàn)血漿 ctDNA KRAS突變水平與NSCLC患者的生存時間、化療療效等相關(guān)[10]。

1.3dPCR技術(shù)在ALK基因重排NSCLC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 約5%的NSCLC患者存在ALK基因重排，其中以與棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4(EMLA4)發(fā)生融合為多見，重排的ALK基因常導(dǎo)致持續(xù)信號激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。出現(xiàn)ALK-EMLA4重排的患者對克唑替尼、色瑞替尼等ALK-TKI敏感[13]，因此，高靈敏的檢測技術(shù)可使更多患者獲得靶向治療機(jī)會。目前，F(xiàn)ISH 或 IHC是ALK基因重排檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其靈敏度較低，檢出限約為15%[14]。作為一種高靈敏度技術(shù)，dPCR 檢測已被設(shè)計用于檢測石蠟樣品中的ALK-EMLA4基因易位，其檢出限達(dá)0.25%[14]。

在耐藥監(jiān)測方面，約有20% ALK基因重排患者在接受第1代 ALK-TKI 克唑替尼治療后，由于激酶結(jié)構(gòu)域的突變而產(chǎn)生耐藥性。因此，如何快速、高通量檢測ALK突變并及時更改用藥，對提高患者預(yù)后具有重要作用。目前已報道超過10個突變與第1代ALK-TKI 耐藥相關(guān)，包括G1202R、F1174C/L、L1196M、G1269A、C1156Y、1151Tins、L1152R、S1206Y、I1171T、D1203N和V1180L等。已有多重dPCR用于檢測多種ALK突變，在一個由7例ALK陽性NSCLC患者組成的小型隊列中，多重dPCR成功地監(jiān)測了疾病過程中不同的ALK耐藥突變狀態(tài)[15]。由于該隊列入組人數(shù)較少，仍需更多的數(shù)據(jù)和研究來進(jìn)一步評估dPCR檢測ALK繼發(fā)性突變的臨床意義及其對NSCLC患者預(yù)后的影響。即便如此，該隊列利用dPCR方法快速而靈敏的技術(shù)特點(diǎn)，通過微創(chuàng)的方法監(jiān)測ALK耐藥性突變，為臨床制訂用藥決策提供新思路。

2 dPCR技術(shù)與乳腺癌(BC)的無創(chuàng)診療

BC是女性頭號殺手，其發(fā)病率最近已超過肺癌，位居癌癥之首。臨床實踐中，BC根據(jù)組織學(xué)和5種分子特征分為3種亞型：激素受體 (HR) 陽性 BC， HER2陽性BC，不表達(dá)HR和HER2的BC(三陰性乳腺癌) 。這些標(biāo)志物可用于預(yù)測BC患者對內(nèi)分泌治療藥物和免疫治療藥物的反應(yīng)。其他靶點(diǎn)包括PIK3CA、雄激素受體、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1、雌激素受體1(ESR1)和程序性死亡受體配體1等也是目前新藥研發(fā)關(guān)注的靶點(diǎn)。dPCR技術(shù)已開始用于BC患者的無創(chuàng)診療過程。研究表明dPCR 等比 Sanger 測序更靈敏的技術(shù)證實了早期 BC 患者手術(shù)前后可在患者血漿中檢測到ctDNA，甚至比傳統(tǒng)方法提前 11 個月預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)，可作為指導(dǎo)臨床診療的高靈敏度的檢測方法[16]。

2.1dPCR技術(shù)在BRCA基因突變BC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 10%的BC患者具有遺傳性，與家族病史有關(guān)。BRCA家族基因是 BC 中最常發(fā)生突變的基因，其畸變會使發(fā)生BC的風(fēng)險增加70%。攜帶BRCA基因突變患者可能會受益于ADP-核糖聚合酶抑制劑，從而改善預(yù)后。BRCA基因改變多樣，包括點(diǎn)突變、大基因組重排或拷貝數(shù)變異(CNV)。Sanger測序和多重連接依賴探針擴(kuò)增 (MLPA) 被認(rèn)為是最可靠的方法[17]。有研究表明， dPCR 在檢測BRCA1基因組重排方面與MLPA具有良好的一致性[18]，但其成本約為MPLA的1/6。另外，MLPA檢測每個基因外顯子至少需要一個單獨(dú)的反應(yīng)，操作煩瑣，目前已經(jīng)開發(fā)出一種基于多通道的更具成本效益的多重dPCR，涵蓋所有編碼和非編碼外顯子，以及2個參考基因(RPP30和ALB)，可克服MLPA這個缺點(diǎn)[17]。

盡管dPCR可用于對液體活檢中的BRCA基因分型，但目前仍處于起步階段，仍需要更多的隊列研究數(shù)據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，以闡明其臨床應(yīng)用和意義。

2.2dPCR技術(shù)在PIK3CA突變BC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 激素療法極大地改善了HR陽性轉(zhuǎn)移性BC(mBC)患者預(yù)后。然而，PIK3CA 9號外顯子 E545K 和 E542K，以及20號外顯子H1047R 和 H1047L 突變常導(dǎo)致激素療法耐藥。采用dPCR技術(shù)檢測血漿 ctDNA 中這些生物標(biāo)志物可用于預(yù)測 BC 療效。已有大量的臨床試驗如PALOMA-3、MIRHO 和 BOLERO-2，采用dPCR技術(shù)用于分析BC患者血漿PIK3CA 突變與臨床療效的關(guān)系。盡管 PALOMA-3 和 MIRHO 試驗未發(fā)現(xiàn)PIK3CA基線水平與PFS之間存在關(guān)聯(lián)，但該研究發(fā)現(xiàn)了血漿PIK3CA突變患者接受氟維司群聯(lián)合治療可延長其PFS[18]。相比之下， BOLERO-2 試驗發(fā)現(xiàn)，PIK3CA突變對其不能從哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑依維莫司二線治療中獲益，不能作為該藥的療效預(yù)測指標(biāo)[19]?？梢?，應(yīng)用dPCR技術(shù)早期鑒定 mBC 患者血漿PIK3CA突變狀態(tài)，可用于更好地指導(dǎo)臨床治療，避免患者重復(fù)接受組織活檢的痛苦。

2.3dPCR技術(shù)在ESR1突變BC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 在雌激素受體陽性mBC患者中，有30%～40%患者發(fā)生ESR1突變[20]。研究表明，多數(shù)接受一線芳香化酶抑制劑(AI)治療的mBC患者在內(nèi)分泌治療期間會獲得ESR1突變，導(dǎo)致耐藥[21]。通過dPCR，一些研究人員分析了外周血中的ESR1突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與僅接受輔助AI治療的患者相比，已接受一線AI治療患者的突變發(fā)生率顯著增加。進(jìn)一步的分析表明ESR1基因Y537S和D538G突變與較短的OS相關(guān)。通過dPCR技術(shù)連續(xù)監(jiān)測BC患者治療過程中ESR1 Y537S、Y537N、Y537C和D538G位點(diǎn)突變水平，結(jié)果顯示AI治療可導(dǎo)致血漿ESR1突變水平波動，治療后ESR1突變水平的增加是導(dǎo)致預(yù)后不良的原因[22]。目前采用dPCR技術(shù)能在2.5%～7.0%的原發(fā)性BC中檢測到ESR1突變[23]。此外，有研究顯示，血漿ESR1突變檢出率甚至高于組織檢出率[24]。

2.4應(yīng)用dPCR技術(shù)檢測血漿HER2水平在BC患者無創(chuàng)診療中的應(yīng)用 在20%～30%的侵襲性BC患者中存在HER2擴(kuò)增。HER2過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和隨后的不良預(yù)后。目前，曲妥珠單抗聯(lián)合帕妥珠單抗可改善HER2(+)的早期BC和mBC患者的PFS和OS[25]。目前評估HER2擴(kuò)增的“金標(biāo)準(zhǔn)”是組織IHC或FISH。盡管對液體活檢中的HER2擴(kuò)增檢測知之甚少，但已有團(tuán)隊通過優(yōu)化dPCR檢測技術(shù)，用于檢測血漿中的HER2 CNV。為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，該團(tuán)隊使用EFTUD2基因作為內(nèi)參，設(shè)計了HER2 dPCR檢測方案，該技術(shù)對76例BC患者的檢測過程中，發(fā)現(xiàn)以腫瘤活檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，該方法的檢測靈敏度達(dá)100%，特異度達(dá)98%[26]。盡管該方法主要是為檢測血漿衍生的cfDNA而開發(fā)的，但它也可以適用于甲醛固定石蠟包埋(FFPE)或新鮮冷凍組織樣本。這些研究提示HER2擴(kuò)增的微創(chuàng)測試將是一個臨床轉(zhuǎn)機(jī)。此外，可以進(jìn)一步優(yōu)化這種方法用于檢測其他擴(kuò)增基因。

3 dPCR技術(shù)與結(jié)直腸癌(CRC)的無創(chuàng)診療

眾所周知，CRC是由參與細(xì)胞復(fù)制、增殖和侵襲性密切相關(guān)調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵基因，如腺瘤性大腸息肉、KRAS、BRAF、PIK3CA和SMAD4集中的幾個突變的積累引發(fā)的。研究發(fā)現(xiàn)CRC組織可釋放大量DNA到血液中，dPCR技術(shù)檢測血漿cfDNA在腫瘤診斷、耐藥監(jiān)測和預(yù)后判斷等患者全程管理方面有良好的應(yīng)用前景[27]。

3.1dPCR技術(shù)與血漿KRAS 和 BRAF檢測及其臨床意義 研究表明，5%～80% CRC患者中可發(fā)現(xiàn)EGFR信號過度激活[28]。過去十余年，大多數(shù)療法主要是針對MAPK 通路的激活或異常信號傳導(dǎo)。然而，KRAS或BRAF突變會導(dǎo)致抗EGFR單克隆抗體治療失敗。一項基于Bio-Rad dPCR、BioCartis Idylla、Roche COBAS z480 和 Sysmex BEAMing 4個檢測平臺用于檢測血漿 ctDNA KRAS突變的檢測效能的比對研究表明，在4個平臺中，dPCR 和 BEAMing靈敏度最高，此外，dPCR和COBAS 可以在單個反應(yīng)中分析多個樣本[29]。另一項回顧性研究表明，無論在與組織檢測結(jié)果的一致性還是檢測通量、重復(fù)性、檢測速度方面，dPCR檢測血漿KRAS突變的能力優(yōu)于COLD-PCR[30]。有研究表明cfDNA 水平與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC) 中的腫瘤突變負(fù)荷之間存在良好的相關(guān)性[30]，也可通過dPCR技術(shù)進(jìn)行CRC的早期篩查，實現(xiàn)精準(zhǔn)防治。在預(yù)后判斷方面，mCRC患者血漿KRAS突變水平具有預(yù)測患者預(yù)后和治療監(jiān)測的能力。在來自前瞻性多中心AIO KRK0207試驗結(jié)果顯示，利用dPCR技術(shù)對患者血漿中的KRAS突變進(jìn)行量化，可通過檢測基線和治療過程中的KRAS突變情況，預(yù)測其OS和PFS[31]。dPCR檢測血漿KRAS突變影像學(xué)可提早10個月預(yù)測疾病進(jìn)展[32]?？梢?，dPCR技術(shù)檢測血漿KRAS突變波動和最終消失可作為預(yù)測CRC患者抗EGFR療效的手段[33]。

3.2dPCR技術(shù)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI)及其臨床意義 DNA錯配修復(fù)缺陷(dMMR)導(dǎo)致DNA微衛(wèi)星中大量DNA復(fù)制錯誤的積累，這種現(xiàn)象被稱為MSI。早期階段CRC患者dMMR/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H) 的頻率為 15%，在 mCRC 中占2%～4%[33]。dMMR/ MSI-H是免疫治療療效的預(yù)測性泛腫瘤生物標(biāo)志物。ctDNA微創(chuàng)檢測MSI-H是一種很有前途的診斷和治療監(jiān)測工具。目前已經(jīng)開發(fā)了一種 dPCR 測定方法來評估微衛(wèi)星標(biāo)志物 BAT-26、ACVR2A 和DEFB105A/B。MSI-dPCR 測定在組織和血液樣本中得到驗證，實現(xiàn)了<0.1%的檢測靈敏度，其檢測結(jié)果與最常用的商業(yè)試劑盒 pentaplex-PCR的測定結(jié)果100%一致[34]。新的 MSI-dPCR 檢測有望成為一種經(jīng)濟(jì)、高效、簡單、快速的診斷工具，用于檢測具有高臨床敏感性的 MSI。此外，該測定同樣適用于固體和液體活檢，還包括具有低 MSI 頻率的腫瘤組織樣本。

4 dPCR技術(shù)與胰腺癌(PC)的無創(chuàng)診療

雖然PC并不常見，但其預(yù)后極差，病死率極高，已成為全球第7大癌癥。已有研究通過多重 dPCR 檢測到的KRAS熱點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，PC晚期患者KRAS突變水平更高，且與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的存在顯著相關(guān)性[35]，血漿KRAS突變發(fā)生率與預(yù)后不良有關(guān)[36]。在一個局部晚期不可切除的 PC 隊列中，治療后血漿KRAS突變水平顯著降低[37]。在一項類似的研究中，研究人員觀察到在治療后 6 個月內(nèi)無法在血漿中檢測到KRAS 突變的患者，其預(yù)后更好[38]。這些結(jié)果與另一項使用多重 dPCR 測定法檢測 16 個KRAS突變的研究結(jié)果一致[35]。

5 其 他

周圍腫瘤區(qū)域中的液體(例如腹膜液)已被證明是有用的 cfDNA 液體活檢來源[39]。在腹膜轉(zhuǎn)移 CRC 患者中，在腹膜液中檢測到的KRAS或BRAF ctDNA 水平明顯高于血漿中的水平[40]。由于尿液收集方便，且具有可重復(fù)多次采集等優(yōu)點(diǎn)，尿液也被列為腫瘤生物標(biāo)志物液體活檢樣本，用于疾病進(jìn)展和藥物反應(yīng)監(jiān)測。在KRAS陽性 mCRC 隊列驗證研究中，從尿液和匹配的血漿樣本中篩選出KRAS或BRAF突變。盡管二者的一致性很低，但它們表明了使用尿液樣本進(jìn)行非泌尿生殖道腫瘤突變篩查的可行性[41]。

已有研究證明，腫瘤組織周圍區(qū)域中的其他 DNA 來源(例如外泌體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和其他體液等)可提供有關(guān)疾病演變的信息[39,42]。dPCR技術(shù)除了檢測血漿中ctDNA外，還可用于血漿外泌體檢測。外泌體是細(xì)胞主動分泌的囊性結(jié)構(gòu)，可提供有關(guān)疾病演變的信息。有研究表明，dPCR用于評估來自外泌體衍生DNA中的KRAS熱點(diǎn)突變，靈敏度和特異度分別為75.4%和92.6%，外泌體中的KRAS突變檢測在所有階段都優(yōu)于血漿cfDNA。此外，局部切除前和切除后突變率分別從66%急劇下降至5%[43]。

6 展 望

液體活檢被認(rèn)為是癌癥管理的良好替代和補(bǔ)充工具。通過靈敏度檢測技術(shù)對特定生物標(biāo)志物的研究可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生在靶向治療期間監(jiān)測疾病進(jìn)展。盡管dPCR已被證明其在檢測罕見的可操作突變方面具有很高的靈敏度和特異度，但仍需要進(jìn)一步的研究以在所有臨床實驗室實施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。另一方面，相較于數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附試驗?zāi)軌蛱岣邔⒚庖邫z測的靈敏度提高到fg/mL級別，實現(xiàn)了高敏蛋白的檢測，dPCR盡管發(fā)展更早，卻在臨床應(yīng)用方面一直難以取得突破，主要是由于dPCR過程有很多技術(shù)難點(diǎn)。因此如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR擴(kuò)增，如何進(jìn)行靈敏的信號檢測和分析，如何提高自動化程度是實現(xiàn)所謂的第3代PCR臨床應(yīng)用推廣的重要突破。