循環(huán)血漿外泌體及其應(yīng)用研究進(jìn)展

陳倩 唐秋萍

海南省血液中心臨床輸血研究室（?？?570311）

外泌體（exosomes）是由細(xì)胞分泌的磷脂雙分子層胞外囊泡樣小體，直徑30～150 nm，呈典型杯狀結(jié)構(gòu)。外泌體于1983 年P(guān)AN 和JOHNSTONE 觀察綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的體外成熟過程時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被JOHNSTONE所命名［1-2］。其組成成分復(fù)雜，據(jù)ExoCarta 外泌體數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，至今已發(fā)現(xiàn)的外泌體中包含9 769 種蛋白質(zhì)、3 408 種mRNA、2 838 種miRNA 和1 116 種脂質(zhì)［3］。外泌體廣泛存在于血漿、尿液、唾液、腦脊液以及腹水等體液中。包括血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎人體所有活細(xì)胞均可分泌外泌體［4］。由于外泌體可通過自分泌、旁分泌方式作用于臨近細(xì)胞，或通過血液循環(huán)長距離運(yùn)輸至遠(yuǎn)端細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊與遺傳信息傳遞，因而在機(jī)體正常生理功能及疾病發(fā)生轉(zhuǎn)歸方面有著重要的作用［5］。來源于循環(huán)血漿的外泌體因易于取樣、侵入性小、成本效益高且便于開展實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)，非常適合作為不同疾病診斷預(yù)后的生物標(biāo)志物和靶向藥物輸送載體并用于臨床治療，故而成為近年來外泌體研究中的熱點(diǎn)研究對(duì)象。本文主要就循環(huán)血漿外泌體在相關(guān)疾病研究和臨床應(yīng)用等方面的進(jìn)展作一闡述。

1 循環(huán)血漿外泌體與疾病

外泌體最初被認(rèn)為是一種清除細(xì)胞代謝廢物的運(yùn)輸工具，但越來越多的研究已證明，包括循環(huán)血漿外泌體在內(nèi)的來源于多種體液的外泌體具有重要的生物學(xué)功能，在不少疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療中都發(fā)揮著重要作用。

1.1 心血管疾病實(shí)驗(yàn)證明，循環(huán)血漿外泌體既可通過影響多種信號(hào)通路介導(dǎo)心血管疾病的病理性損傷過程，同時(shí)來自健康供者血漿外泌體中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等特異性分子也可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖分化和存活、加速血管生成、減少凋亡以及抑制纖維化等機(jī)制發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用［6-7］。在對(duì)慢性心血管疾病充血性心衰發(fā)病機(jī)制的研究中就發(fā)現(xiàn)，來自健康供者循環(huán)血漿的外泌體能夠利用miR-126 靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞中多種關(guān)鍵細(xì)胞因子的產(chǎn)生和旁分泌過程，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞粘附分子、促炎性蛋白的表達(dá)，參與調(diào)控單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用以及慢性心衰的發(fā)病過程，因而可作為充血性心衰的潛在治療工具［8］。對(duì)急性心肌梗死患者的研究也證明，來自健康供者血漿外泌體的miR-342-3p 可分別通過靶向性別決定區(qū)Y 框6 基因（sex determining region Y box 6，SOX6）介導(dǎo)的凋亡和轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）介導(dǎo)的自噬來減輕心肌細(xì)胞損傷，從而參與外泌體介導(dǎo)的心臟修復(fù)［9］。

1.2 神經(jīng)退行性疾病由于外泌體及其組成成分參與了神經(jīng)系統(tǒng)包括神經(jīng)保護(hù)與修復(fù)、神經(jīng)炎癥、突觸可塑性和病理分子的擴(kuò)散傳播等多種生理和病理過程，因此它們被認(rèn)為是研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和預(yù)測疾病進(jìn)展的理想對(duì)象［10］。細(xì)胞外毒性β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成神經(jīng)炎性斑和細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的tau 蛋白形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)是阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）的主要病理特征。最近的研究表明，外泌體中也含有A? 和tau 蛋白。外泌體不僅可以介導(dǎo)Aβ 寡聚體（Aβ oligomers，oAβ）在神經(jīng)元之間的傳播，也可介導(dǎo)病理性tau蛋白的擴(kuò)散，從而促進(jìn)疾病進(jìn)展。通過阻斷外泌體的形成、分泌或攝取，可以減少Aβ 寡聚體和tau蛋白的擴(kuò)散及相關(guān)的毒性，表明外泌體在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中起著重要作用［11-12］。對(duì)比阿爾茨海默病患者和健康對(duì)照者循環(huán)血漿外泌體的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白42、總tau 蛋白（Ttau）和磷酸化tau 蛋白（P-tau）181 等多種蛋白成分存在差異表達(dá)。此外，阿爾茨海默病患者血漿外泌體Aβ1-42 和P-S396-tau 表達(dá)水平要顯著高于匹配的健康對(duì)照者，而且外泌體的體積相對(duì)較小，數(shù)量也較低，這些都有助于區(qū)分阿爾茨海默病患者與健康個(gè)體［10，13］。因此從循環(huán)血漿大量的外泌體中尋找發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，對(duì)于進(jìn)一步了解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，協(xié)助疾病診斷具有重要意義。

1.3 內(nèi)分泌疾病1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mel?litus，T1DM）是由于自身反應(yīng)性T 細(xì)胞攻擊胰島β 細(xì)胞引起的慢性免疫性疾病。雖然關(guān)于T1DM發(fā)病機(jī)制尚不完全清除，但有研究認(rèn)為，胰島β 細(xì)胞與免疫細(xì)胞，特別是與T 淋巴細(xì)胞之間的異常相互作用，是主要致病機(jī)制之一［14］。越來越多的證據(jù)顯示，外泌體可能是β細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的新型介質(zhì)，并通過多種機(jī)制參與了T1DM 的進(jìn)展。T 淋巴細(xì)胞釋放的外泌體可通過外泌體miRNA 介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡，而胰島來源的外泌體含有β 細(xì)胞自身抗原，可以被抗原提呈細(xì)胞吸收并激活，從而啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)［15-16］。最近有研究團(tuán)隊(duì)分析了與 T1DM 進(jìn)展相關(guān)的循環(huán)血漿外泌體中circRNA、lncRNA 和mRNA 的表達(dá)譜，同時(shí)構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過揭示各種基因及其上游元件在T1DM 進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制，為更好的理解外泌體在T1DM 發(fā)病中的潛在作用提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［17-19］。

1.4 血液系統(tǒng)疾病外泌體可在參與機(jī)體正常造血的同時(shí)，也在惡性血液病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著干擾正常造血的作用。研究表明，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）來源的外泌體不僅可通過誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)基因的表達(dá)改變，使支持正常造血和成骨的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，從而抑制骨髓的正常造血，也可通過抑制正常造血干細(xì)胞的功能來影響造血［20-21］。此外，來自患者循環(huán)血漿的外泌體還可將骨髓生態(tài)位改造成有利于白血病細(xì)胞生長且抑制正常造血的微環(huán)境［22］。而循環(huán)血漿外泌體中的二肽基肽酶4（dipeptidyl?peptidase 4，DPP4/CD26），是一種具有造血調(diào)節(jié)功能的絲氨酸蛋白酶，它可在體外抑制正常人造血祖細(xì)胞的分化，干擾造血功能。實(shí)驗(yàn)證明通過藥理學(xué)抑制該病患者血漿外泌體二肽基肽酶4 的活性可以逆轉(zhuǎn)外泌體介導(dǎo)的骨髓抑制作用［23］。這些研究結(jié)果提示阻斷外泌體對(duì)造血功能的負(fù)面調(diào)控可能是急性髓系白血病和其他白血病的一種新的治療方法。

1.5 其他疾病研究顯示，血漿外泌體作為重要的生物介質(zhì)，不僅參與了調(diào)節(jié)和維持如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性免疫性血小板減少癥等自身免疫性疾病的發(fā)生與進(jìn)展［24-25］，在對(duì)全身感染性疾病膿毒癥的研究中也證明，循環(huán)血漿外泌體對(duì)膿毒癥患者的免疫系統(tǒng)也具有潛在調(diào)節(jié)作用，參加了膿毒癥的多種病理過程，且血漿外泌體水平與器官衰竭的嚴(yán)重程度以及膿毒癥危重患者的死亡率預(yù)測均相關(guān)［26-27］。

2 循環(huán)血漿外泌體的臨床應(yīng)用

最近幾年的研究中，外泌體的臨床應(yīng)用逐漸成為一個(gè)主要的探索領(lǐng)域。循環(huán)血漿外泌體在腫瘤的診斷和治療、靶向藥物載體的構(gòu)建和免疫治療藥物的開發(fā)上，均表現(xiàn)出了良好的研究和應(yīng)用前景［28］。

2.1 腫瘤診斷標(biāo)志物外泌體在不同類型腫瘤診斷方面的巨大潛力已經(jīng)獲得了廣泛的認(rèn)識(shí)，以外泌體作為生物標(biāo)志物在腫瘤臨床診斷中表現(xiàn)出多種優(yōu)勢：首先外泌體表達(dá)其來源的宿主細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物，因而可識(shí)別其來源；其次外泌體由脂質(zhì)雙分子層封閉包裹，在保護(hù)其所攜帶的生物活性物質(zhì)不被胞外蛋白酶所降解的同時(shí)，保證了內(nèi)含物的穩(wěn)定性和完整性；并且外泌體內(nèi)含物的含量和釋放都受到嚴(yán)格的生理和病理狀況調(diào)控，可反映身體的生物狀態(tài)，提供活細(xì)胞的實(shí)時(shí)信號(hào)［29］。除以上優(yōu)勢外，血漿作為臨床常規(guī)檢測樣本，可通過無創(chuàng)或微創(chuàng)途徑方便獲取，簡便易行、可重復(fù)操作、不易感染且成本低，因而相較于其他來源的外泌體，循環(huán)血漿外泌體更加適合用于腫瘤早期診斷、監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估。

已有越來越多的證據(jù)表明循環(huán)血漿中的外泌體參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，可為腫瘤的早期診斷提供重要信息。在肝細(xì)胞癌（hepatocel?lular carcinoma，HCC）的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中長鏈非編碼RNA RP11-85G21.1（lnc85）的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌患者中顯著升高，對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷具有重要意義［30］。對(duì)肺腺癌（lung adenocarci?noma，LUAD）的研究則顯示，肺腺癌患者血漿外泌體中趨化因子配體7（C-X-C chemokine ligand 7，CXCL7）mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯增加，提示血漿外泌體CLCL7 可成為肺腺癌早期診斷的有效生物標(biāo)志物［31］，而血漿外泌體miR-221 則認(rèn)為對(duì)非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）表現(xiàn)出較好的輔助診斷價(jià)值［32］。此外，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者中，血漿外泌體miRNA-23b 的低表達(dá)被證明與與多個(gè)不良臨床病理學(xué)因素及較短的總生存期密切相關(guān)，并有助于結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估［33］。由于與傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物相比，外泌體表現(xiàn)出更高的診斷靈敏度、準(zhǔn)確性和可靠性，因而可作為腫瘤早期輔助診斷的一種新型理想生物標(biāo)記物。

2.2 腫瘤免疫治療隨著研究認(rèn)識(shí)到外泌體作為細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵信使，可參與腫瘤和免疫細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)控，外泌體在腫瘤免疫治療中的作用引起廣泛關(guān)注。研究表明，腫瘤患者血漿外泌體可向免疫細(xì)胞遞送抑制性貨物，誘導(dǎo)免疫抑制，降低免疫細(xì)胞的的抗腫瘤活性。對(duì)頭頸部腫瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿外泌體攜帶免疫抑制分子，可通過誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞凋亡，抑制CD4+T 細(xì)胞增殖，抑制NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性來干擾免疫細(xì)胞的功能，抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)［34］。而對(duì)B 細(xì)胞的研究同樣顯示，血漿外泌體在體外對(duì)B 細(xì)胞的增殖、存活和功能也具有生理性抑制作用［35］。HONG 等［36］發(fā)現(xiàn)患有晚期惡性腫瘤的患者血漿中的外泌體可以干擾免疫治療，對(duì)急性髓系白血病患者接受NK-92 細(xì)胞過繼性免疫治療的研究顯示，來自患者血漿的外泌體除攜帶白血病相關(guān)抗原外，還含有細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed death-1 ligand，PD-L1）等多種免疫抑制分子，在體外可抑制NK-92 細(xì)胞的細(xì)胞毒性、分化、增殖和定向遷移等多種功能，并對(duì)NK-92 細(xì)胞進(jìn)行重新編程，從而干擾活化免疫細(xì)胞的抗白血病活性，并可能限制過繼細(xì)胞療法的預(yù)期治療效果 。

腫瘤患者血漿中外泌體是腫瘤細(xì)胞來源的外泌體（tumor-derived exosomes，TEX）和非腫瘤細(xì)胞來源的外泌體的混合物，后者主要是免疫細(xì)胞來源的外泌體（immune cell-derived exosomes，IEX）。因此，對(duì)腫瘤患者血漿外泌體的檢測，可以部分反映腫瘤狀態(tài)和機(jī)體的免疫功能。比如，腫瘤患者血漿中外泌體的數(shù)量和外泌體表面免疫調(diào)節(jié)蛋白PD-L1 的水平，被認(rèn)為與疾病的活動(dòng)性、腫瘤分期和預(yù)后具有相關(guān)性，患者血漿外泌體中PD-L1 水平越高，疾病活動(dòng)性越強(qiáng)且分期更晚。此外，PDL1+外泌體可劑量依賴性抑制T 細(xì)胞活性，血漿外泌體PD-L1 含量越高，其抑制CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞活化的能力就越強(qiáng)［37］。最近THEODORAKI 等［38］的研究結(jié)果顯示，腫瘤患者接受化療治療和隨訪期間，總外泌體蛋白水平，腫瘤/免疫細(xì)胞來源外泌體的比例以及外泌體的免疫抑制活性均會(huì)發(fā)生顯著變化，表明通過檢測循環(huán)血漿外泌體可以準(zhǔn)確反映腫瘤患者的整體免疫狀態(tài)以及治療過程中免疫反應(yīng)的變化。因而血漿外泌體有望作為一種潛在的非侵入性生物標(biāo)記物，代替免疫細(xì)胞，用于患者對(duì)腫瘤治療反應(yīng)的監(jiān)測以及預(yù)后療效的評(píng)價(jià)。

2.3 靶向藥物輸送載體外泌體可將宿主細(xì)胞本身所包含的多種生物活性分子從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并影響后者的生物學(xué)特性，所以天然的成為一種富有吸引力的藥物輸送載體。不同于之前的脂質(zhì)體或聚合物納米顆粒等合成納米藥物載體，外泌體作為一種高效納米級(jí)藥物輸送系統(tǒng)，具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：如出色的生物相容性、高度的代謝穩(wěn)定性、低免疫原性、低毒性、主動(dòng)靶向性和特異性以及良好的生物膜滲透能力［29］。目前通過運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、聲波降解、電穿孔、凍融循環(huán)、表面活性劑處理和透析等多種物理、化學(xué)以及生物技術(shù)，可將治療藥物裝載到外泌體中并封存，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)不同的治療效果，同時(shí)發(fā)揮藥物的最佳有效性［39］。血液特別是血漿，是外泌體的豐富來源，非常適合治療中的應(yīng)用。神經(jīng)退行性疾病的治療過程中，血腦屏障的存在往往阻礙了大多數(shù)藥物的通過。研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)修飾的血液外泌體對(duì)大腦具有良好的天然靶向能力。通過飽和溶液培養(yǎng)法，可將治療藥物多巴胺有效裝載到血液外泌體中，并成功輸送到包括紋狀體和黑質(zhì)在內(nèi)的大腦區(qū)域，在帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）小鼠模型中已顯示出良好的治療效果［40］。在對(duì)另一神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病的治療中發(fā)現(xiàn)，裝載治療藥物懈皮素（quercetin，Que） 的血漿外泌體，可增強(qiáng)懈皮素的腦靶向性，顯著提高藥物的生物利用率［41］。表明血液尤其是循環(huán)血漿外泌體可作為未來富有前景的疾病靶向治療藥物輸送平臺(tái)。

2.4 恢復(fù)期血漿外泌體免疫治療過去20 年間，人們曾在包括流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome，MERS）等在內(nèi)的歷次病毒爆發(fā)中都成功使用了恢復(fù)期血漿治療這一方法［42］。新型冠狀病毒感染（coronavirus dis?ease 2019，COVID-19）疫情期間，對(duì)于部分嚴(yán)重感染者，這種被動(dòng)免疫療法再次發(fā)揮了重要作用。然而該療法中，供者的血漿會(huì)存在廣泛的抗體效價(jià)變異，且伴隨傳播傳染性病原體的風(fēng)險(xiǎn)，此外對(duì)于危重患者可能增加炎癥和血栓級(jí)聯(lián)反應(yīng)，罕見情況下，還可能導(dǎo)致輸血相關(guān)急性肺損傷。因此更多的研究圍繞恢復(fù)期血漿的衍生產(chǎn)品而展開，其中恢復(fù)期血漿外泌體被認(rèn)為對(duì)COVID-19 重癥感染者的治療具有重要意義［43］。在對(duì)恢復(fù)期血漿外泌體免疫機(jī)制及生物活性的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿中源于活化的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如Th1 細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞等分泌的外泌體，可能在恢復(fù)期血漿的治療中發(fā)揮了有效的免疫功能。這些外泌體大多能以足夠的敏感性和特異性識(shí)別抗原，并觸發(fā)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。同時(shí)外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移包括tRNA、rRNA、mRNA 和miRNA 等在內(nèi)的RNA，也會(huì)在表觀遺傳學(xué)上影響受體對(duì)病毒的反應(yīng)［44-45］?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，研究者們最近利用COVID-19 感染患者恢復(fù)期免疫血漿源性外泌體開發(fā)了新型治療劑ChipEXO?。該制劑在體外試驗(yàn)中顯示出強(qiáng)大的抗病毒特性，并具有促進(jìn)組織保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)功能［46］。在隨后進(jìn)行的單中心前瞻性、開放標(biāo)簽、單臂介入研究中，ChipEXO? 作為霧化吸入物用于治療因呼吸衰竭而入住ICU 的重癥COVID-19 患者，也顯示出了良好的安全性和有效性，未來有望成為治療COVID-19 介導(dǎo)肺損傷的一種新型治療策略［47］。

3 展望

外泌體作為一個(gè)嶄新的、迅速擴(kuò)展的研究熱點(diǎn)，近年來受到了國內(nèi)外研究者們的廣泛關(guān)注，圍繞外泌體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究取得了相當(dāng)成功，外泌體分離提取技術(shù)已極大優(yōu)化，臨床應(yīng)用研發(fā)進(jìn)程也在被快速推進(jìn)。然而外泌體尤其是循環(huán)血漿外泌體的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究仍面臨不少瓶頸問題，比如如何更有效的獲得高產(chǎn)量和高純度的循環(huán)血漿外泌體，如何明確循環(huán)血漿外泌體與其他組織和器官相互作用的具體機(jī)制，以及如何更好的增強(qiáng)循環(huán)血漿外泌體作為藥物輸送載體的負(fù)載能力和靶向性。相信隨著外泌體研究工作的深入，通過開展更廣泛的多學(xué)科研究，克服現(xiàn)有生物技術(shù)的局限性，將能更好的提高外泌體在臨床診斷和治療中的應(yīng)用潛力。