基于風(fēng)險管理的口腔產(chǎn)品和化妝品原料實時微生物快速檢驗替代方法的方法學(xué)驗證

郭 莉 賈紹強 劉 燕 琚童霞 余思宜 楊蘇成

(云南白藥集團股份有限公司,云南 昆明 650200)

在口腔護理產(chǎn)品和化妝品生產(chǎn)中，微生物是必須重點控制的項目。如果消費者使用遭到微生物污染的口腔護理產(chǎn)品和化妝品，會給人們的身體健康造成不同程度的影響[1]，還會影響品牌的良好形象。因此必須嚴格控制口腔護理產(chǎn)品和化妝品的微生物。我國在化妝品的質(zhì)量安全方面一直比較重視，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，在化妝品微生物檢測上檢測的范圍也逐漸增多，2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[2]要求對于微生物檢測主要是細菌總數(shù)與霉菌和酵母菌總數(shù)。把總數(shù)控制于標準以下的前提下，不得檢測出耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。目前按照2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對微生物的檢測方法中，對菌落總數(shù)的檢測需要兩天，霉菌和酵母菌數(shù)的檢測需要5天，耐熱大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測需要2～3天，金黃色葡萄球菌的檢測需要約3～5天，檢驗周期較長。公司生產(chǎn)用口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料面臨著用量大、周轉(zhuǎn)快、時間緊的局面，需要引入快速準確的檢測技術(shù)，在保證檢驗結(jié)果準確可靠的前提下，有效縮短口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗時間，滿足快速精準放行需求。當前BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)以其簡便省時、實時快速、準確靈敏、檢測量大的特點，充分滿足了質(zhì)量保證所提出的更高要求[3]。

BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)通過將染色、新的光源和光傳感器相結(jié)合，能夠用同一個檢測器同步檢測顏色和熒光信號的變化。當代謝過程發(fā)生時，試劑的光譜模式會發(fā)生改變。光傳感器可檢測到這些改變，并以預(yù)先設(shè)定的6分鐘為間隔進行監(jiān)控[4]。該技術(shù)目前已被應(yīng)用于原奶、乳制品、食品保健品、化妝品的微生物檢測以及水廠、政府監(jiān)管部門、科研院所。

初步確認BioFirst實時雙溫微生物快速檢測系統(tǒng)對幾種口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢測的適用性后，本研究收集了其中兩種不同類型的口腔護理產(chǎn)品和化妝品原料二氧化硅H型和山梨醇，參照《中國藥典[5](2020版)》附錄藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，從專屬性、檢測限、重復(fù)性以及耐用性四個方面考察與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢驗方法相比是否存在差異，評估采用BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)進行口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗替代2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢驗方法的可行性，為該方法作為口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料快速檢測和放行的可靠方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)，菌落總數(shù)檢測管，霉菌和酵母菌數(shù)檢測管，耐熱大腸菌群檢測管，銅綠假單胞菌檢測管，銅綠假單胞菌添加劑，金黃色葡萄球菌檢測管，金黃色葡萄球菌添加劑，均為上海美凱純生物科技有限公司；培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，冰箱，生化培養(yǎng)箱，生物安全柜，定量菌種，渦旋振蕩器，移液器等。

1.2 試驗樣品

二氧化硅H型(批號：F2107027 和F2108030)、山梨醇(批號：F2108062 和F2108063)。

1.3 菌種選擇

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司定量菌種。

2 二氧化硅H型和山梨醇替代方法的驗證

2.1 專屬性試驗

2.1.1 樣品稀釋液的制備:分別稱取每種兩個批號樣品10g，加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的樣品瓶中,充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1∶10的稀釋液，每個批號平行取3次。

2.1.2 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)專屬性試驗方法：取1∶10的樣品稀釋液(2.1.1制備)按樣品限量值(企業(yè)內(nèi)控標準)做進一步稀釋；將樣品稀釋液分裝到空試管中，每個試管中分裝9mL樣品稀釋液，加入1mL 102～103CFU/mL的菌落總數(shù)菌懸液(按照定量菌株說明書制備大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌混合液)、1mL 102～103CFU/mL霉菌和酵母菌菌懸液(按照定量菌株說明書制備黑曲霉和白色念珠菌混合液)，使樣品稀釋液含菌量<100CFU/mL；混合均勻后，分別取1mL加入菌落總數(shù)檢測管、霉菌和酵母菌數(shù)檢測管內(nèi)，菌落總數(shù)檢測管37℃上機檢測，霉菌和酵母菌數(shù)檢測管28℃上機檢測，機器自動檢測，在機器運行過程出現(xiàn)DT(檢測時間)，則表明樣品中的菌含量大于限定值；儀器未檢出(無DT)，則表明樣品中菌含量小于限定值；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測。

2.1.3 耐熱大腸菌群專屬性試驗方法：選取大腸埃希菌作為菌種。從制備好的10～100CFU/ml菌懸液中取1mL加入到9mL樣品稀釋液中，使樣品含菌量<100CFU。増菌：上述加了菌的樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至90mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，于44.5±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；取増菌后的樣液1mL加入到大腸菌群檢測管，混勻后上機在44℃進行檢測，機器運行過程中，如果出現(xiàn)DT(檢測時間)，則樣品報告為陽性；儀器未檢出(無DT)，則報告為耐熱大腸菌群陰性；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測。

2.1.4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌專屬性試驗方法：分別從制備好的10～100CFU/ml銅綠假單胞菌菌懸液和金黃色葡萄球菌菌懸液中取1mL加入到9mL樣品稀釋液中，使樣品含菌量<100CFU。増菌：分別將上述加了菌的樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；取増菌后的含銅綠假單胞菌樣液0.1mL加入到銅綠假單胞菌檢測管，另加0.1mL添加劑，混勻后上機在36℃進行檢測；取増菌后的含金黃色葡萄球菌樣液0.5mL加入到金黃色葡萄球菌檢測管，另加0.2mL添加劑，混勻后上機在36℃進行檢測；機器運行過程中，如果出現(xiàn)DT(檢測時間)，則樣品報告為陽性；儀器未檢出(無DT)，則報告為陰性；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測。

2.1.5 專屬性試驗結(jié)果分析：菌落總數(shù)BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在20h內(nèi)檢出，霉菌和酵母菌數(shù)BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在48h內(nèi)檢出，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在10h內(nèi)檢出；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法也均檢出；兩種方法的專屬性沒有差異。試驗結(jié)果見表1。

表1 專屬性試驗結(jié)果

2.2 檢測限試驗

2.2.1 檢測限試驗方法：方法與專屬性試驗方法相同，加菌量為使樣品稀釋液含菌量<5CFU/mL，每個批號樣品每種試驗菌重復(fù)進行10次。

2.2.2 檢測限試驗結(jié)果分析：BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)對菌落總數(shù)和霉菌酵母菌的個位數(shù)的菌均能檢出，對加到樣品中極少的(每g樣品中添加0～5個菌)耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能夠檢出，增菌后的樣品能夠在10小時內(nèi)快速檢出；對菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測限結(jié)果進行統(tǒng)計，使用Fisher確切概率法分析后顯示快檢法和國標法檢測限試驗結(jié)果無顯著性差異。檢測限試驗結(jié)果見表2。

表2 檢測限試驗結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗

2.3.1 重現(xiàn)性試驗方法：由不同的的實驗人員在不同的時間使用相同批號二氧化硅H型和山梨醇進行重現(xiàn)性試驗，試驗方法同專屬性試驗方法。

2.3.2 重現(xiàn)性試驗結(jié)果分析：由不同的實驗人員進行試驗，菌落總數(shù)BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在20h內(nèi)檢出，霉菌和酵母菌數(shù)BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在48h內(nèi)檢出，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)均在10h內(nèi)檢出；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法也均檢出；結(jié)果表明兩種方法的重現(xiàn)性無明顯差異。

2.4 耐用性試驗

2.4.1 耐用性試驗方法：菌落總數(shù)、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和耐熱大腸菌群降低培養(yǎng)溫度8℃，霉菌和酵母菌數(shù)升高培養(yǎng)溫度8℃，試驗方法同專屬性試驗方法，對BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)的耐用性進行試驗。

2.4.2 耐用性試驗結(jié)果分析：升高或者降低培養(yǎng)溫度后，BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)耐熱大腸菌群報出的檢測時間和專屬性試驗的基本一致，其他四種菌雖有所延長，也都能給出陽性結(jié)果，說明該方法在培養(yǎng)溫度適度改變的情況下，檢驗結(jié)果基本不受影響，方法仍可以使用。耐用性試驗結(jié)果見表3。

試驗項目快檢法(h)二氧化硅H型F2107027F2108030山梨醇F2108062F2108063菌落總數(shù)10.610.610.410.811.011.013.013.014.014.414.815.0霉菌和酵母菌數(shù)23.223.423.223.223.223.223.622.222.422.622.622.4耐熱大腸菌群2.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.6銅綠假單胞菌2.63.33.73.64.14.44.74.23.66.04.44.8金黃色葡萄球菌6.62.62.62.66.36.54.44.94.24.54.54.8

3 討論

通過對BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)方法和2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法的專屬性、檢測限、重復(fù)性和耐用性的驗證試驗，結(jié)果表明兩種方法基本一致。BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)方法可作為二氧化硅H型和山梨醇微生物檢測的替代方法。但是口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料種類繁多，有的具有一定抑菌性，需要擴大驗證范圍，最終確定通用的原料陰性確定時間。BioFirst實時微生物快速檢測系統(tǒng)方法在得到準確的檢測結(jié)果的同時，大大縮短檢測時間，避免了配制分裝培養(yǎng)基及傾注平板的步驟，簡化樣品前處理程序，且準確的檢測結(jié)果使樣品微生物檢測變得更加快速、方便，有利于產(chǎn)品在獲得準確檢測結(jié)果下的快速放行和質(zhì)量管理人員的科學(xué)決策。