瑪咖脂溶性成分的GC-MS指紋圖譜的構(gòu)建及溯源*

李明， 王濤， 陳芮

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.)為十字花科(Brassicaceae)獨(dú)行菜屬植物瑪咖的干燥根莖[1]，始產(chǎn)于秘魯，有“秘魯人參”之佳譽(yù).最早瑪咖用于解決人和牲畜的不孕不育問(wèn)題，同時(shí)能增強(qiáng)人的免疫力，消除疲勞[2].

瑪咖的活性成分主要為瑪咖烯、瑪咖酰胺、生物堿、芥子油苷、異硫氰酸芐酯、甾醇及多酚等[3-4].這些活性成分使瑪咖具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[5]、預(yù)防前列腺肥大[6]及抗腫瘤[7]等作用.研究表明：瑪咖中特有的瑪咖烯和瑪咖酰胺具有改善性功能的作用[8].Uchiyam等[9]首次證實(shí)了瑪咖酰胺能夠提高性激素,為瑪咖能夠改善性欲的傳統(tǒng)說(shuō)法提供了理論支持.劉淼等[10]發(fā)現(xiàn)黑瑪咖中的N-芐基十六酰胺和N-十八烷酰胺為瑪咖抗疲勞的有效成分.周?chē)?yán)嚴(yán)等[11]采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)受損的神經(jīng)模型，研究了瑪咖總提取物對(duì)神經(jīng)的作用，并采用乙酰膽堿酶和丁酰膽堿酶進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：瑪咖中對(duì)體內(nèi)和體外神經(jīng)皆具有保護(hù)作用的有效成分為N-芐基十六烷酰胺.Liu等[12]發(fā)現(xiàn)N-芐基十六烷酰胺是瑪咖抗骨質(zhì)疏松的有效成分.孟倩倩和楊敏等[13-14]研究表明瑪咖中脂溶性成分以苯乙腈和N-芐基十六烷酰胺為主.

由于瑪咖具有多種生物活性，近年來(lái)瑪咖的市場(chǎng)需求迅速增加，云南、四川和西藏等地競(jìng)相引種瑪咖[15]，但是由于環(huán)境的不同，引種瑪咖的化學(xué)成分與含量差異較大，因此研究產(chǎn)地對(duì)瑪咖成分及含量的影響顯得尤為重要.

研究采用超聲輔助提取法對(duì)瑪咖中脂溶性成分進(jìn)行提取，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)這些成分進(jìn)行鑒定.通過(guò)對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建了瑪咖的指紋圖譜.在此基礎(chǔ)上，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)(夾角余弦法)及化學(xué)模式識(shí)別(主成分分析，PCA)對(duì)瑪咖脂溶性成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)以期為瑪咖快速溯源提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

SY-360型超聲波清洗器(廣東固態(tài)特超聲股份有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ThermoFisher TSQ 9000型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(美國(guó)Thermofisher Scientific公司).

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用中國(guó)云南香格里拉、中國(guó)云南麗江、中國(guó)云南曲靖、中國(guó)云南昆明、中國(guó)四川樂(lè)山、中國(guó)西藏林芝及秘魯胡寧等7個(gè)產(chǎn)地的瑪咖均購(gòu)于云南省昆明市豐熙茶行；所用石油醚為分析純，購(gòu)于云南省景銳科技有限公司；所用正己烷為分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脂溶性成分的提取

稱(chēng)取10.0 g瑪咖粉，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，超聲提取(功率360 W、頻率40 KHz)3次，每次1 h，過(guò)濾，減壓濃縮，揮干.用正己烷溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供后續(xù)GC-MS分析用.

2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：進(jìn)樣口溫度270 ℃；載氣為高純度氦氣，柱前壓9.785 3 psi，載氣流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流，分流比100∶1，分流流量120 mL/min.采用程序升溫的方式分離脂溶性成分.初始溫度50 ℃，以10 ℃/min速率升溫至150 ℃；以1 ℃/min速率升溫至180 ℃，保持3 min；以1 ℃/min速率升溫至200 ℃；再以3 ℃/min速率升溫至270 ℃，保持5 min.

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；溶劑延遲4 min；m/z范圍40～550 amu.

3 結(jié)果與討論

3.1 瑪咖樣品共有峰的確認(rèn)及指紋圖譜的確定

采用GC-MS得到7個(gè)產(chǎn)地的瑪咖樣品的數(shù)據(jù)，通過(guò)分析基峰和m/z，參考NIST MS Search 2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果及分析匹配度，對(duì)瑪咖中的脂溶性成分進(jìn)行定性分析；對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行積分，結(jié)合峰面積歸一化法計(jì)算共有成分的相對(duì)含量[16-17].

7個(gè)不同產(chǎn)地瑪咖的脂溶性成分的GC-MS圖譜如圖1所示.通過(guò)譜庫(kù)檢索及圖譜對(duì)照發(fā)現(xiàn)，在55 min處出現(xiàn)了面積較大的色譜峰，由于峰裂分較嚴(yán)重，經(jīng)檢索匹配度較低，因此并未對(duì)此峰進(jìn)行積分分析.通過(guò)GC-MS在瑪咖樣品中共檢測(cè)出91種揮發(fā)性成分，其中酰胺類(lèi)和酯類(lèi)在揮發(fā)性成分中含量最高，其次為酸類(lèi).結(jié)果顯示：西藏林芝瑪咖中脂溶性成分的峰面積較大，與其他6個(gè)產(chǎn)地的瑪咖之間存在顯著的差異.

圖1 7個(gè)產(chǎn)地瑪咖的脂溶性成分的GC-MS指紋圖譜

選取了保留時(shí)間相差很小的15個(gè)共有峰作為研究對(duì)象，經(jīng)NIST MS Search 2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，都為相同脂溶性成分.7個(gè)產(chǎn)地瑪咖的15個(gè)脂溶性成分的峰面積之和占總峰面積的百分比介于73.37%～88.86%之間.

由于保留時(shí)間為8.237 min的苯乙腈的峰面積較大且積分相對(duì)穩(wěn)定，具有良好的參照效果，因此選擇苯乙腈的色譜峰作為15個(gè)共有特征峰的參照峰，將苯乙腈的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積都設(shè)定為1，在此基礎(chǔ)上計(jì)算其他所有共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)保留值(見(jiàn)表1).從表1可知，7個(gè)產(chǎn)地的瑪咖的15種脂溶性成分在GC-MS上的保留時(shí)間具有相對(duì)穩(wěn)定性但峰面積相差較大.

表1 15種脂溶性成分色譜峰的相對(duì)保留面積

3.2 瑪咖脂溶性成分的數(shù)字化特征指紋圖譜

所構(gòu)建的瑪咖脂溶性成分的數(shù)字化特征指紋圖譜如表2所示.從表2可知，脂溶性成分的指紋圖色譜峰相對(duì)保留時(shí)間主要集中在0.954～10.531之間.表中結(jié)果說(shuō)明,不同產(chǎn)地瑪咖的同一種成分的保留時(shí)間差異較小，出峰穩(wěn)定，相對(duì)含量具有一定差異，可以進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建及瑪咖溯源.

表2 瑪咖脂溶性成分的數(shù)字化指紋圖譜

3.3 瑪咖指紋圖譜的相似度分析

采用夾角余弦法對(duì)7個(gè)產(chǎn)地瑪咖樣品的脂溶性成分的GC-MS 指紋圖譜進(jìn)行相似度分析.結(jié)果表明：15種脂溶性成分的色譜峰夾角余弦的相關(guān)系數(shù)在 0.900 1～0.989 4 之間，說(shuō)明不同產(chǎn)地的瑪咖樣品具有較好的相似度，可用于建立新型的瑪咖GC-MS指紋圖譜.

3.4 主成分分析

由于7個(gè)產(chǎn)地的瑪咖脂溶性成分共有特征峰具有一定的相似性，但脂溶性成分的相對(duì)含量不同，因此可采用PCA法對(duì)不同來(lái)源瑪咖進(jìn)行分析.其KMO為0.788，P為0.000，進(jìn)一步表明這些數(shù)據(jù)適用于PCA法分析.

利用SPSS軟件從表2的數(shù)據(jù)中提取3個(gè)主成分.表3給出了15個(gè)瑪咖脂溶性成分的3個(gè)主要組成部分的特征.PC1為3-甲氧基苯乙腈，PC1的特征值和累積百分比分別為6.946和46.309%；PC2為亞油酸甲酯，PC2的特征值和累積百分比分別為4.121和27.474%；PC3為N-芐基十六烷酰胺，PC3的特征值和累積百分比為2.275和15.163%；總累計(jì)百分比為88.947%.

用等級(jí)來(lái)評(píng)估不同來(lái)源瑪咖的質(zhì)量，結(jié)果如表3所示.麗江瑪咖得分為0.304，在這些樣本中排名最高；而昆明瑪咖得分為-0.095，在這些樣本中得分最低.

表3 不同溯源瑪咖樣品中脂溶性成分的綜合得分和排名

圖2給出了采用PCA方法對(duì)這些樣本進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分的直觀圖.從圖中可以看出PCA法能夠根據(jù)瑪咖中3種主要的脂溶性成分的相對(duì)含量清晰的區(qū)分不同產(chǎn)地的瑪咖.

PC1、PC2和PC3預(yù)測(cè)產(chǎn)地和主成分的相關(guān)性.

4 結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用GC-MS 對(duì)7個(gè)產(chǎn)地瑪咖中的脂溶性成分進(jìn)行了分析，采用峰面積歸一化法計(jì)算了各成分的相對(duì)含量.檢測(cè)到了15種主要的共有脂溶性成分，其中3-甲氧基苯乙腈、亞油酸甲酯及N-芐基十六烷酰胺等3種脂溶性成分的相對(duì)含量較高.

結(jié)合夾角余弦法及PCA法以相對(duì)含量穩(wěn)定的 15 種脂溶性成分的特征值為指紋峰，建立了瑪咖脂溶性成分的 GC-MS指紋圖譜.特征峰的相似度均達(dá)到了 0.900 1以上，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以作為分析與鑒別瑪咖的依據(jù).分析表明，不同產(chǎn)地瑪咖的脂溶性成分相對(duì)含量具有顯著的差異；PCA法能夠根據(jù)相對(duì)含量有效地對(duì)不同產(chǎn)地的瑪咖進(jìn)行鑒別.該方法為瑪咖快速溯源提供了參考，也為瑪咖質(zhì)量分析與鑒定提供了依據(jù).