化學(xué)發(fā)光免疫分析法在梅毒螺旋體抗體檢測中的應(yīng)用探究

雪 洲

（平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院，甘肅 平?jīng)?744000）

梅毒螺旋體（TP）為慢性性傳播疾病，由感染梅毒螺旋體（TP）所致。該病可經(jīng)由母嬰、血液、性接觸等途徑傳播，在發(fā)病早期不具有明顯癥狀，而隨著病毒在全身的持續(xù)擴(kuò)散，可出現(xiàn)梅毒疹及淋巴結(jié)腫大、高熱等全身癥狀，及至晚期，可導(dǎo)致多臟器功能受累，使患者生命健康受到顯著損害[1]。故對梅毒做出早期診斷并給予有效治療極為重要。既往常用的梅毒檢測方法有酶聯(lián)法（ELISA）、甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗（TRUST）、明膠顆粒凝集試驗（TPPA）等，其中TPPA被認(rèn)為是確認(rèn)TP抗體（TP-Ab）最佳的方法，但其具有操作步驟復(fù)雜、檢測費(fèi)用昂貴、用時長等缺陷，在一定程度上限制其較大范圍應(yīng)用[2]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）為近幾年興起的一種血清學(xué)檢測方法，有研究指出，其在TP-Ab檢測中的靈敏度、特異度均較高，且操作簡單、檢測用時短[3]。本研究運(yùn)用CLIA對TP-Ab進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其檢測效能優(yōu)于ELISA、TRUST，且和TPPA一致性良好，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

以2019年2月—2021年5月甘肅省平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院接收的258例行TP-Ab檢測的患者為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大、發(fā)燒、頭痛等；（2）意識清醒，無精神疾??；（3）臨床資料完備。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）曾接受抗梅毒治療；（2）凝血功能異常；（3）臟器嚴(yán)重功能病變；（4）不配合檢查?；颊咧心?36例，女122例；年齡21～75歲，平均（48.96±5.02）歲；體重指數(shù)（BMI）18.7～24.8 kg/m2，平均（21.78±1.95）kg/m2；學(xué)歷：初中或以下103例，高中/中專91例，高中以上64例；婚姻狀況：未婚67例，已婚或離異191例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

空腹采集患者肘正中靜脈血5 mL，室溫靜置2 h左右，血液凝固后在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，獲得血清后于-20 ℃環(huán)境下冷藏待測。

1.2.2 檢測方法

CLIA檢測方法：取樣本、磁微粒各50 μL，將其置于微孔板內(nèi)，再加入100 μL酶結(jié)合物，在37 ℃溫度下孵育0.5 h，利用磁分離洗滌器進(jìn)行4次洗滌，然后注入100 μL發(fā)光底物，室溫下避光反應(yīng)5 min，最后使用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（廠商：安圖生物，型號：AutoLumo A2000）測定發(fā)光強(qiáng)度。樣品的發(fā)光量（S）/臨界值（C）達(dá)到或超過1判定為陽性。

ELISA檢測方法：依照ELISA試劑盒（上海科華生物工程股份有限公司）說明書開展操作，即取50 μL樣本，將其注入預(yù)包被條孔處，并設(shè)置為3個對照孔（陰性、陽性與空白對照），在37℃溫度下孵育1 h，取50 μL酶標(biāo)物注入陰性、陽性對照孔內(nèi)，混合均勻后置于37 ℃溫度下孵育0.5 h，隨后將50 μL底物緩沖液注入各對照孔內(nèi)，混合均勻后置于37 ℃溫度下孵育0.5 h，顯色再取50 μL終止液注入各孔內(nèi)，輕輕搖均后在酶聯(lián)免疫檢測儀（廠商：南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，型號：DG5031型）上判讀結(jié)果。樣品吸光度（A）值（S）/臨界值（CO）達(dá)到或超過1判定為陽性。

TRUST檢測方法：將50 μL血清置于卡片圈內(nèi)，使其均勻涂布于整個圈內(nèi)。將抗原搖勻，加入血清圈內(nèi)。將卡片置于脫色搖床上，搖勻后在亮光下用肉眼觀察。如見凝集塊則判定為陽性。

TPPA檢測方法：每份樣本做9孔，將標(biāo)本稀釋液注入U型反應(yīng)板內(nèi)，其中1孔內(nèi)注入量為100 μL，其余孔注入量為25 μL，于1孔內(nèi)注入25 μL血清，混合均勻后取25 μL加入至2孔，依次稀釋至9孔，在3孔內(nèi)注入25 μL未致敏粒子D液，4及后面的其他孔注入25 μL C液，振蕩0.5 min后置于有蓋濕盒內(nèi)20～25 ℃避光靜止置2 h，對結(jié)果進(jìn)行觀察。粒子散開，陽性滴度為1:80判定為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計CLIA、ELISA、TRUST 對TP-Ab 的檢出情況，并以TPPA為金標(biāo)準(zhǔn)，計算上述3種方法的檢測效能。此外，分析3種方法檢測結(jié)果和TPPA檢驗結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0軟件分析，用百分比描述計數(shù)資料，以χ2檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa＜0.4、0.4～0.7、＞0.7分別表示一致性差、中等、良好，檢驗水準(zhǔn)=0.05。

2 結(jié)果

2.1 比較3種方法的檢測結(jié)果

258例患者中經(jīng)TPPA檢出TP-Ab陽性83例，陰性175例；CLIA檢出陽性84例，陰性174例；ELISA檢出陽性81例，陰性177例，TRUST檢出陽性69例，陰性152例，見表1。

表1 3種方法的檢測結(jié)果比較（例）

2.2 比較3種方法的檢測效能

CLIA、ELISA 對TP-Ab的檢測效能明顯優(yōu)于TRUST（P均＜0.05），且CLIA檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于ELISA（P均＜0.05），見表2。

表2 3種方法的檢測效能比較 [例（%）]

2.3 檢測結(jié)果的一致性分析

對CLIA、ELISA、TRUST檢測結(jié)果和TPPA檢驗結(jié)果進(jìn)行一致性進(jìn)分析，結(jié)果顯示，Kappa分別為0.991、0.928、0.681。提示CLIA、ELISA和TPPA檢驗結(jié)果的一致性良好，TRUST和TPPA檢驗結(jié)果的一致性中等。

3 討論

梅毒為一種對人體具有極大危害的性病，不僅可損害患者健康，還可通過性行為在人群間傳播，并能通過胎盤傳染給胎兒，對其子女身心發(fā)展產(chǎn)生不良影響[4]。TP為梅毒的病原體，當(dāng)人體遭受其感染后可生成兩種抗體：一種是特異性TP-Ab，包括IgM和IgG等兩種，前者產(chǎn)生時間早，但維持時間短，消失迅速。后者產(chǎn)生時間略晚，但可長期留存于人體內(nèi)，甚至終身留存[5]。另一種為非特異性TP-Ab，是由受到TP破壞的細(xì)胞組織所釋放的一種具有抗體性質(zhì)的物質(zhì)。而通過檢測血液中是否存在TP-Ab，可為梅毒診斷提供幫助。

血清學(xué)檢驗方法為TP-Ab檢測的主要方法，目前，采用的血清學(xué)檢驗方法頗多，其中TPPA、ELISA、TRUST、CLIA較為常用。TPPA原理是在明膠顆粒上包被TP Nichols株的精制純化抗原，和樣本中的TPAb結(jié)合形成凝集反應(yīng)[6]。此方法對TP-Ab的檢測效果較高，多用于梅毒確診試驗中。但由于其檢測費(fèi)用較高、操作繁瑣、檢測時間長，故不宜于梅毒大樣本檢測[7]。ELISA為TP-Ab檢測的傳統(tǒng)方法，其是利用基因重組工程合成TP抗原包被于滴定板處，并采用雙抗原夾心法對血清中TP-Ab進(jìn)行檢測。該方法適合大樣本檢測，但受實驗室環(huán)境因素、機(jī)體內(nèi)在因素影響，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8-9]。TRUST為一種非特異性TP-Ab血清檢測法，其結(jié)果具有清晰易讀、穩(wěn)定性好等特點，但靈敏度并不高，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，如慢性腎炎、麻風(fēng)病、紅斑狼瘡等疾病患者血清中可檢測出非特異性TP-Ab[10]。CLIA為一種檢測特異性TP-Ab的先進(jìn)方式，其是將發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記于抗原或抗體上，待免疫反應(yīng)完成后添加酶底物促使發(fā)光。通過測定發(fā)光強(qiáng)度，并基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到待測物含量[11]。此方法檢測原理和ELISA相似，但區(qū)別在于CLIA以發(fā)光物質(zhì)取代酶為標(biāo)記物，并采用儀器測定發(fā)光強(qiáng)度來實現(xiàn)定量分析[12]。有研究報道指出，CLIA對梅毒檢測的靈敏度、特異度分別高達(dá)97.67%、98.85%[13]。在本研究中，CLIA檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為100.00%、99.43%、99.61%，ELISA分別為93.98%、98.29%、96.90%，TRUST分別為83.13%、86.86%、85.66%。CLIA、ELISA檢測效能和TRUST相比明顯較優(yōu)（P均＜0.05），CLIA靈敏度、準(zhǔn)確度和ELISA相比明顯較優(yōu)；CLIA和TPPA檢驗結(jié)果的一致性良好。說明CLIA對TP-Ab的檢測效能優(yōu)于ELISA、TRUST，和TPPA相當(dāng)，有助于提高對梅毒診斷的準(zhǔn)確性。究其原因，CLIA加入發(fā)光底物后產(chǎn)生的化學(xué)信號穩(wěn)定性好，維持時間長，且能夠避免光源照射因素對結(jié)果分析的影響，故可提高結(jié)果的可靠度[14]。加之其具有操作簡便、耗時短、易自動化等特點，故可用于對梅毒的大樣本篩查中。

綜上所述，CLIA對TP-Ab的檢測效能媲美TPPA，優(yōu)于ELISA、TRUST，可減少漏誤診的發(fā)生。且其可實現(xiàn)批量操作，不失為一種梅毒篩查的有效方法。