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    大豆GmPDAT1 參與油脂合成和非生物脅迫應(yīng)答的功能分析

    2023-03-07 12:55:00苗淑楠高宇李昕儒蔡桂萍張飛薛金愛季春麗李潤植
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:擬南芥酵母元件

    苗淑楠 高宇 李昕儒 蔡桂萍 張飛 薛金愛 季春麗 李潤植

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801)

    大豆(Glycine max)是世界范圍內(nèi)重要的糧油作物和工業(yè)原料[1-2]。隨著全球生態(tài)環(huán)境的惡化,低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫制約大豆生產(chǎn)日趨嚴(yán)重。因此,解析大豆油脂合成及抗逆性分子機(jī)制對(duì)大豆產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性的遺傳改良和可持續(xù)生產(chǎn)具有重要的意義。

    植物油脂主要以三酰甘油(triacylglycerol,TAG)的形式貯藏于種子中[3]。植物貯藏油脂合成包括脂肪酸從頭合成和三酰甘油的合成。植物合成TAG 有2 種途徑:一種是依賴?;?CoA 的Kennedy 途徑[4];另一種是不依賴?;?CoA 的合成途徑。在后者中,磷脂:二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶(phospholipid: diacylglycerol acyltransferase, PDAT)能將磷脂(phospholipids, PC)分子中的?;D(zhuǎn)移到二酰甘油(diacylglycerol, DAG)分子的sn-3 位碳原子上,進(jìn)而合成TAG[5-6]。最早在釀酒酵母鑒定獲得PDAT基因,迄今已從擬南芥(Arabidopsis thaliana)[7]、油茶(Camellia oleifera)[8]、亞麻(Linum usitatissimum)[9]、油菜(Brassica napus)[10-11]、花生(Arachis hypogaea)[12]、 向日 葵(Helianthus annuus)[13]、大豆(Glycine max)[14]、橄欖果(Olea europaea)[15]和一些藻類[16]等植物中克隆到PDAT基因并鑒定其功能。已有研究顯示來自不同物種PDAT基因的功能以及編碼的酶蛋白活性存在差異。Zhang 等[17]在擬南芥Atpdat1突變體中用RNAi 抑制AtPDAT1表達(dá)時(shí),種子油含量降低70%,而沉默AtPDAT2未導(dǎo)致種子油含量降低,表明AtPDAT1參與種子油脂合成積累。相似地,在擬南芥葉片中過表達(dá)AtPDAT1導(dǎo)致油含量升高和脂肪酸組成改變[7]。與AtPDAT1 相比,擬南芥AtPDAT2[17]、蓖麻(Ricinuscommunis)RcPDAT2[18]和亞麻LuPDAT6[8](PDAT2同系物)均不參與TAG 的合成。另有研究顯示,PDAT 也參與植物非生物脅迫響應(yīng)。Yuan 等[19]發(fā)現(xiàn)亞麻薺(Camelina sativa)不同PDAT 成員分別參與亞麻薺幼苗低溫、干旱和鹽脅迫的應(yīng)答。Mueller等[20]發(fā)現(xiàn)擬南芥pdat突變體在高溫脅迫后無法積累TAG。Demski 等[21]在擬南芥中過表達(dá)PDAT1,增強(qiáng)了植物對(duì)冷熱脅迫的適應(yīng)性,延緩了植物衰老進(jìn)程。

    目前,關(guān)于大豆PDAT家族成員的功能以及是否參與脅迫應(yīng)答尚不清楚。本研究基于組學(xué)分析,全基因組鑒定大豆GmPDAT1家族成員、GmPDAT1基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件,預(yù)測GmPDAT1蛋白功能結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育。通過熒光定量PCR,分析GmPDAT1基因家族各成員在大豆不同組織的表達(dá)模式,特別是在大豆低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫下表達(dá)譜。應(yīng)用酵母TAG缺陷型突變體功能互補(bǔ)測試體系,分析GmPDAT1催化TAG 合成的生物學(xué)功能,為全面解析大豆GmPDAT1 成員精準(zhǔn)生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),亦為植物油脂代謝和抗逆性遺傳改良提供新的科學(xué)根據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)選用大豆品種Jack,種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)基地,分別選取大豆根、莖、葉、花、豆莢和種子,液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    選取發(fā)育良好、長勢一致、展開至2 片真葉的大豆幼苗,于Hoagland 營養(yǎng)液中進(jìn)行脅迫處理。分別用4℃、250 mmol/L NaCl、20% PEG 處理大豆幼苗,于光照16 h/黑暗8 h 的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。分別取0、3、6、9、12、24 和48 h 的真葉作為檢測材料,液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆?,設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)。

    1.2 方法

    1.2.1 大豆GmPDAT1基因家族生物信息學(xué)分析 以來自擬南芥數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)的AtPDAT1(AT5G13640.1)為索引序列,在Phyto zome v13 大豆基因組(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中進(jìn)行Blast 分析,全基因組鑒定大豆GmPDAT1家族成員。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的在線工具CDD(https://www.ncbi.nlmnih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)GmPDAT1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;利用MEME(http://memesuite.org/index.html) 預(yù) 測GmPDAT1 的Motif;利 用TBtools 軟件分析GmPDAT1基因結(jié)構(gòu);通過ProtParam 在線分 析 軟 件(https//web.expasy.org/protparam/) 分 析GmPDAT1 的理化性質(zhì);利用TMHM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用SOPMA 在線分析軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),利用SWISS-MDEL 在線分析軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive)構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;使用Genedoc 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析;使用MEGA 11.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建;利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)GmPDAT1啟動(dòng)子順勢作用元件進(jìn)行分析。

    1.2.2 總RNA 提取及RT-qPCR 使用植物RNA 快速提取試劑盒(Aidlab 公司)提取正常培養(yǎng)條件下大豆不同組織和3 種非生物脅迫處里后各時(shí)間段的大豆幼苗RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA(采用Genstar 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。利用Primer 6.0 設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1),選用GmActin為內(nèi)參基因。熒光定量采用TaKaRa 的體系,反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s;95℃ 5 s,57℃ 30 s,39 個(gè)循環(huán)。

    表1 引物信息Table 1 Primer information

    1.2.3GmPDAT1-B的克隆 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增GmPDAT1-B的CDS 全長,程序?yàn)?4℃ 2 min;94℃15 s,68℃ 45 s,68℃ 2 min,35 個(gè) 循 環(huán);68℃ 5 min。將擴(kuò)增獲得的目標(biāo)序列與pMD18-T 載體連接,送至擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序,鑒定獲得正確的GmPDAT1-B編碼序列克隆。

    1.2.4 大豆GmPDAT1-B酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)KpnI 和EcoR I 的擴(kuò)增引物,將GmPDAT1-B亞克隆至酵母表達(dá)載體pYES2上。用醋酸鋰(LiAc)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pYES2-GmPDAT1-B轉(zhuǎn)化至釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TAG 缺陷型突變株H1246,使用SC-Ura(2%葡萄糖)固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,挑取單菌落進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化株檢測。利用氯仿甲醇法提取酵母細(xì)胞總脂,具體步驟及油脂含量計(jì)算參考周雅莉等[22]方法,然后進(jìn)行薄層層析(thin layer chromatography,TLC)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 GmPDAT1的基因結(jié)構(gòu)分析

    以擬南芥AtPDAT1 蛋白序列為索引序列,在大豆基因組中進(jìn)行BLAST 比對(duì),共檢測到6 個(gè)大豆GmPDAT1基因家族成員,分別命名為GmPDAT1-A(Glyma.17G051300.1)、GmPDAT1-B(Glyma.13G10 8100.1)、GmPDAT1-C(Glyma.07G036400.1)、GmPDAT1-D(Glyma.16G005800.1)、GmPDAT1-E(Glyma.12G084000.1)和GmPDAT1-F(Glyma.11G190400.1)。這6 個(gè)基因的蛋白和擬南芥AtPDAT1 蛋白都屬于PLN02517 超家族成員,具有典型的磷脂酰膽堿-甾醇O-?;D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。利用MEME 對(duì)AtPDAT1和GmPDAT1 蛋白進(jìn)行Motif 預(yù)測,結(jié)果(圖1-A)顯示,6 個(gè)大豆GmPDAT1 蛋白與擬南芥AtPDAT1 蛋白的Motif 的數(shù)量和位置基本相同,具有高度保守性。基因結(jié)構(gòu)(圖1-B)所示,GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D和GmPDAT1-E與AtP-DAT1類似,均含有6 個(gè)外顯子,且具有5′和3′非編碼區(qū),GmPDAT1-F具有8 個(gè)外顯子,不具有非編碼區(qū)。

    圖1 GmPDAT1 和AtPDAT1 蛋白Motif 預(yù)測(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)分析Fig. 1 Motif prediction(A)and gene structure(B)analysis of GmPDAT1 and AtPDAT1 proteins

    2.2 GmPDAT1蛋白的理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    通過Protparam(https//web.expasy.org/protparam/)和TMHM(https//web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件預(yù)測大豆GmPDAT1和擬南芥AtPDAT1編碼的蛋白質(zhì)氨基酸組成、理化性質(zhì)及蛋白跨膜結(jié)構(gòu),結(jié)果(表2)顯示,這些蛋白長度介于582-676 aa,理論等電點(diǎn)(pI)5.91-8.59,親水性系數(shù)均為負(fù)值,為親水性蛋白。預(yù)測的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均為36.12-44.95,為不穩(wěn)定蛋白。GmPDAT1 和AtPDAT1 顯示具有跨膜結(jié)構(gòu)域,短的親水性N 端面向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),大部分C 端位于膜內(nèi)。

    表2 大豆 Gm PDAT1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of GmPDAT1 proteins in G. max

    二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,GmPDAT1 和AtPDAT1 蛋白主要是由α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成,其中,α 螺旋和無規(guī)則卷曲占比較高,α 螺旋占比為34.43%-41.07%,無規(guī)則卷曲占比為45.51%-37.11%,β-轉(zhuǎn)角占比小,為5.18%-6.72%(圖2-A),說明α 螺旋和無規(guī)則卷曲是主要組成構(gòu)件。以溶酶體磷脂酶A2 為模板進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)建模顯示,大豆GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D、GmPDAT1-E、GmPDAT1-F蛋白氨基酸序列與模板相似度分別為24.44%、25.45%、26.94%、26.36%、24.79% 和23.08%( 圖2-B)。預(yù)示這6 個(gè)來自大豆的GmPDAT1 蛋白可能具有AtPDAT1 的功能。

    圖2 大豆GmPDAT1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)Fig. 2 Secondary structures(A)and tertiary structures(B)of soybean GmPDAT1 proteins

    2.3 GmPDAT1蛋白的多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析

    將大豆GmPDAT1 家族與擬南芥AtPDAT1 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì),6 個(gè)大豆GmPDAT1均具有LCAT 超家族典型的保守結(jié)構(gòu)域,包括蓋子區(qū)域( I),鹽橋區(qū)域(Ⅱ)和催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(Ⅲ, Ⅳ,Ⅴ)。其中,蓋子區(qū)域內(nèi)的Trp(色氨酸)與酶活性位點(diǎn)中裂解的脂肪酸結(jié)合,Asp 和Arg 之間的鹽橋區(qū)域可能參與到磷脂識(shí)別(圖3)。

    圖3 大豆GmPDAT1 蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Amino acid sequence alignment of GmPDAT1 proteins in G. max

    使用MEGA11.0 軟件,將大豆GmPDAT1 與其他已知功能的植物PDAT1 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。大豆GmPDAT1-A 與GmPDAT1-B 在同一分支,與花生(Arachis hypogaea)AhPDAT1 親緣關(guān)系較近;GmPDAT1-C 與GmPDAT1-D 在另一分支,與小桐子(Jatropha curcas)JcPDAT1、蓖麻(Ricinus communis)RcPDAT1-1 和油橄欖(Olea europaea)Oep-PDAT1 親緣關(guān)系較近。GmPDAT1-E 與GmPDAT1-F與蓖麻RcPDAT1-2 親緣關(guān)系較近,聚類在同一分支(圖4)。

    圖4 大豆GmPDAT1 與其他物種PDAT1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of soybean GmPDAT1s and PDAT1s from other plant species

    2.4 GmPDAT1啟動(dòng)子的順式作用元件分析

    分析發(fā)現(xiàn)GmPDAT1編碼區(qū)上游2 000 bp 啟動(dòng)子中存在多個(gè)逆境和激素應(yīng)答元件(圖5)。所有的GmPDAT1啟動(dòng)子區(qū)都含有厭氧誘導(dǎo)元件(ARE,AAACCA)。GmPDAT1-A和GmPDAT1-E啟動(dòng)子區(qū)含有低溫響應(yīng)元件(LTR, CCGAAA),GmPDAT1-B和GmPDAT1-F存在干旱誘導(dǎo)元件(MBS, CAACTG),GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F存在防御與脅迫應(yīng)答元件(TC-rich,ATTCTCTAAC),說明這些GmPDAT1可能與逆境應(yīng)答相關(guān)。多個(gè)激素響應(yīng)類元件也存在于GmPDAT1啟動(dòng)子中,例如所有GmPDAT1基因都存在較多的ABA 應(yīng)答元件(ABRE, ACGTG);GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D和GmPDAT1-F存在茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)元件(CGTCA 和TGACG);GmPDAT1-C和GmPDAT1-D存在生長素應(yīng)答元件(TGA-element, AACGAC);G m P D A T 1-A、G m P D A T 1-B、G m P D A T 1-D、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F存在赤霉素應(yīng)答元件(GARE, TCTGTTG; P-box, CCTTTTG 和TATC-box,TATCCCA)。表明GmPDAT1家族基因可能受到不同激素的調(diào)控。

    圖5 大豆GmPDAT1 啟動(dòng)子的順式作用元件Fig. 5 Cis-acting element identified in the promoters of soybean GmPDAT1 genes

    2.5 GmPDAT1在大豆不同組織中的表達(dá)模式

    RT-qPCR 結(jié)果(圖6)顯示,GmPDAT1在大豆不同組織中的表達(dá)量不相同,其中,GmPDAT1-A、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F在大豆各組織中的表達(dá)量極低;GmPDAT1-B在各個(gè)組織中均表達(dá),但在種子中的表達(dá)量高;GmPDAT1-C和GmPDAT1-D在大豆根、莖、葉、花和豆莢中高表達(dá),但在種子中幾乎不表達(dá)。

    圖6 GmPDAT1 在大豆不同組織中的特異性表達(dá)Fig. 6 Specific expressions of GmPDAT1 in different tissues of soybean

    2.6 轉(zhuǎn)GmPDAT1-B 酵母突變體H1246 恢復(fù)油脂合成能力

    釀酒酵母突變株H1246 為TAG 合成缺陷株,該突變體敲除了細(xì)胞內(nèi)能夠合成TAG 的4 個(gè)基因,DGA1(DGAT2 家族成員)、LRO1(甘油二酯?;D(zhuǎn)移酶)、ARE1和ARE2(?;o酶A:膽固醇?;D(zhuǎn)移酶),因此缺乏合成TAG 的能力[23]。將GmPDAT1-B轉(zhuǎn)入酵母H1246,分析轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞三酰甘油的合成積累量來驗(yàn)證GmPDAT1-B在TAG合成中的功能??傊瑴y定結(jié)果顯示(圖7-A),與轉(zhuǎn)空載的酵母相比,GmPDAT1-B的表達(dá)提高了H1246酵母的總脂含量,但沒有野生型酵母INVSc1 總脂含量高。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)GmPDAT1-B酵母總脂進(jìn)行TLC分析(圖7-B),缺陷型酵母H1246 和轉(zhuǎn)空載體的TAG 條帶處均未檢測到斑點(diǎn),而轉(zhuǎn)GmPDAT1-B的H1246 酵母明顯形成TAG 斑點(diǎn),說明GmPDAT1-B具有PDAT 酶活性,使H1246 酵母恢復(fù)了合成TAG的能力。

    圖7 GmPDAT1-B 的酵母互補(bǔ)功能驗(yàn)證Fig. 7 Complementary function assay of GmPDAT1-B gene using yeast mutant H1246

    2.7 GmPDAT1響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

    為探究GmPDAT1在大豆抗脅迫中的作用,進(jìn)一步分析不同非生物脅迫下大豆GmPDAT1的表達(dá)特性。RT-qPCR 結(jié)果(圖8)顯示,在不同脅迫處理下,GmPDAT1均受到誘導(dǎo)表達(dá)。在4℃低溫脅迫處理下,GmPDAT1-B表達(dá)量在12 h 時(shí)達(dá)到最高,為對(duì)照的7.26 倍,隨后逐漸降低。GmPDAT1-C表達(dá)量在24 h 達(dá)到最高,為對(duì)照的5.24 倍。與對(duì)照相比,GmPDAT1-D表達(dá)量在處理后24 h 內(nèi)明顯降低,但在48 h 時(shí)又有所升高。GmPDAT1-F表達(dá)量先升高后降低又升高,在處理48 h 后的表達(dá)量達(dá)到最高,為對(duì)照的21.85 倍。然而,GmPDAT1-A和GmPDAT1-E在對(duì)照和低溫脅迫處理的大豆幼苗表達(dá)量均較低、且無顯著差異。

    圖8 大豆GmPDAT1 在不同脅迫處理下的表達(dá)譜Fig. 8 Relative expressions of soybean GmPDAT1 under different stress treatments

    在250 mmol/L NaCl 處理下,GmPDAT1-B表達(dá)量先升高后降低又升高,表達(dá)量最高值出現(xiàn)在處理后48 h,為 對(duì) 照 的44.32 倍。GmPDAT1-A、GmPDAT1-C和GmPDAT1-E表達(dá)量均在鹽脅迫48 h 時(shí)達(dá)到最高,較未脅迫時(shí)分別提高了8.16、14.02 和9.44倍。GmPDAT1-D基因表達(dá)量先降低后升高又降低,在處理9 h 后隨脅迫時(shí)間繼續(xù)升高,在處理48 h 后表達(dá)量為對(duì)照的1.23 倍。GmPDAT1-F在對(duì)照和鹽脅迫處理幼苗中的表達(dá)量無顯著變化。

    在20%的PEG 模擬干旱處理下,GmPDAT1-A表達(dá)量先升高后降低又升高再降低,表達(dá)量最高值出現(xiàn)在處理后的24 h,為對(duì)照的13.45 倍。GmPDAT1-B表達(dá)量呈持續(xù)上調(diào)趨勢,在處理48 h 后的表達(dá)量達(dá)到最高,為對(duì)照的23.58 倍。GmPDAT1-C表達(dá)量在48 h 處達(dá)到最高,為對(duì)照的5.69 倍。GmPDAT1-D表達(dá)量與對(duì)照相比明顯降低,而GmPDAT1-E和GmPDAT1-F在干旱脅迫處理和對(duì)照大豆幼苗中的表達(dá)量無顯著改變。

    根據(jù)上述RT-qPCR 分析結(jié)果,GmPDAT1-B在低溫、鹽和干旱脅迫條件下表達(dá)量均顯著上調(diào),由此推測GmPDAT1-B可能在大豆抵抗低溫、鹽和干旱等非生物脅迫中均發(fā)揮重要作用。

    3 討論

    大豆是世界上重要的油料作物,種子富含有利于人體健康的不飽和脂肪酸,培育高油品種和提高大豆油產(chǎn)量始終是大豆遺傳育種和大豆生產(chǎn)主攻領(lǐng)域。PDAT 是TAG 合成過程中酰基輔酶A 非依賴途徑中的關(guān)鍵酶,在擬南芥和一些重要油料作物中發(fā)現(xiàn)PDAT1 在TAG 合成過程中具有重要作用,但在大豆中的研究十分有限。本研究從大豆基因組中得到GmPDAT1家族的6 個(gè)成員,這6 個(gè)GmPDAT1基因均屬于PLN02517 超家族。生物信息學(xué)分析表明,GmPDAT1與擬南芥PDAT1內(nèi)含子/外顯子數(shù)量基本一致,編碼蛋白的保守基序也一致或相似,說明PDAT 基因進(jìn)化過程是保守的。RT-qPCR 顯示,6個(gè)GmPDAT1在大豆不同組織中的表達(dá)量存在差異,GmPDAT1-B在種子中的表達(dá)量最高,推測其參與種子的油脂合成。進(jìn)一步通過酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明,GmPDAT1-B 具有催化TAG 生物合成的酶活性。

    在逆境條件下,脂質(zhì)成分發(fā)生變化以促進(jìn)膜系統(tǒng)穩(wěn)定從而提高植物的抗逆性[24]。已有報(bào)道顯示PDAT 在植物抵御脅迫方面也發(fā)揮重要作用[25],植物體內(nèi)的膜脂動(dòng)態(tài)平衡與PDAT調(diào)控基因相關(guān)[7]。低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫嚴(yán)重限制大豆的生長并導(dǎo)致減產(chǎn)。因此,培育高抗逆境脅迫且高含油的大豆品種尤為重要。本研究分析發(fā)現(xiàn),大豆GmPDAT1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在幾種脅迫誘導(dǎo)的順式作用元件,包括低溫誘導(dǎo)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)元件(MBS)、防御和脅迫響應(yīng)元件(Tc-rich)。這些順式作用元件的存在預(yù)示著大豆GmPDAT1可能參與脅迫響應(yīng)。進(jìn)一步RT-qPCR 分析顯示,不同GmPDAT1成員在非生物脅迫下的表達(dá)模式存在差異。GmPDAT1-B在干旱、低溫和鹽脅迫等3 種逆境條件下的表達(dá)水平均明顯高于其他基因,預(yù)示著大豆PDAT1成員可能在大豆非生物脅迫的調(diào)控中起到重要作用。GmPDAT1-B表達(dá)特性與花生AhPDAT1[12]和擬南芥AtPDAT1[21]在非生物脅迫下的表達(dá)模式基本一致。另外據(jù)報(bào)道,有些植物中,在TAG 合成中發(fā)揮作用的DGAT基因也響應(yīng)逆境脅迫,例如在三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中,PtDGAT1在氮脅迫下被上調(diào)表達(dá)[26],在氮富集條件下,DGAT2B在TAG 積累開始之前被大量表達(dá)[27]。擬南芥幼苗受到ABA、茉莉酸、水楊酸、高鹽和干旱脅迫處理后,AtDGAT1的表達(dá)顯著上調(diào)[28],TAG 的積累也增加。本研究顯示,GmPDAT1在調(diào)控大豆油脂和抗逆境應(yīng)答發(fā)揮雙重功能。植物非生物脅迫誘導(dǎo)TAG 形成的代謝過程及脂質(zhì)代謝是否有助于植物獲得抗逆性仍有待闡明。盡管我們沒有測試在非生物脅迫下GmPDAT1轉(zhuǎn)基因株系導(dǎo)致的各種生理生化及基因表達(dá)的變化,后期將進(jìn)一步驗(yàn)證GmPDAT1的功能。PDAT1在非生物脅迫中的作用可能解釋是與溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamines, LPE)相關(guān),在TAG 合成過程中,PDAT將磷脂分子上的?;D(zhuǎn)移至DAG 后,剩下的副產(chǎn)品是溶血磷脂酰膽堿(lysophospholipids: lysophosphatidylcholine, LPC)和LPE,而LPE 長期以來一直被稱為植物衰老阻燃劑[29]。PDAT1過表達(dá)可能導(dǎo)致增加植物組織中的LPE 含量,進(jìn)而促進(jìn)抗逆性提高。也有研究提出,各種非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致膜脂重塑,有助于TAG 合成所需的DAG 形成[20]。而PDAT 將脂肪?;糠謴腜C 轉(zhuǎn)移到DAG,進(jìn)而合成TAG,因此顯示出PDAT 對(duì)非生物脅迫下TAG 的積累是必需的,TAG 的富集亦有利于植物組織的脅迫抗性。

    4 結(jié)論

    鑒定獲得6 個(gè)大豆GmPDAT1基因,編碼蛋白由582-668 個(gè)氨基酸祖成,蛋白序列高度保守,均具有PLN02517 超家族蛋白結(jié)構(gòu)域。GmPDAT1家族成員在不同組織以及低溫、鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式存在顯著差異。GmPDAT1-B在發(fā)育種子中表達(dá)量最高,且在低溫、鹽和干旱脅迫3 種逆境條件下的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。GmPDAT1-B 具有催化TAG生物合成的酶活性。GmPDAT1-B 可能具有促進(jìn)油脂合成和脅迫抗性的雙重功能,可作為大豆遺傳改良的一個(gè)優(yōu)異候選靶標(biāo)。

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