膠體金免疫層析卡優(yōu)化及其與ELISA法檢測(cè)克倫特羅殘留的比較

劉穎沙 劉昭彤 邢維維 魯瑤 岳彩洋 楊洋

（1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院 陜西楊凌 712100；2. 中國(guó)空間技術(shù)研究院西安分院陜西西安 710100；3. 北京維德維康生物技術(shù)有限公司 北京 100095）

克倫特羅（瘦肉精，CL）是用來促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、降低肥肉率的一種人工合成腎上腺素受體，其在組織內(nèi)會(huì)有殘留，消費(fèi)者食用后會(huì)危害身體健康。中國(guó)自2001年開始嚴(yán)禁銷售含有瘦肉精的肉類及配合飼料。然而，近些年，豬肉瘦肉精中毒事件屢屢皆是，2021年“3·15”新聞播出，如今，豬肉中的瘦肉精還沒有完全解決，又被發(fā)現(xiàn)在羊肉中添加，使消費(fèi)者對(duì)肉制品出現(xiàn)恐慌心理[1-3]。

克倫特羅性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長(zhǎng)，很容易在動(dòng)物體內(nèi)造成積累，人一旦食用殘留過多鹽酸克倫特羅的動(dòng)物制品，就會(huì)造成食物中毒，嚴(yán)重者甚至死亡，世界各國(guó)已紛紛禁止將CL用作獸用飼料添加劑。但目前仍有許多不法分子違規(guī)使用，這對(duì)食品安全造成了重大隱患。因此，為確保食品安全，維護(hù)消費(fèi)者的健康，急需建立快速、可靠的克倫特羅檢測(cè)方法。

對(duì)于克倫特羅的檢測(cè)方法常見的有肉眼觀察法、化學(xué)分析法、酶聯(lián)免疫法、色譜分析技術(shù)，隨著消費(fèi)者對(duì)肉制品品質(zhì)要求的提高，以及現(xiàn)有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、人員的不足，快速檢測(cè)法更加適用，對(duì)克倫特羅的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)法最常見的是膠體金快速檢測(cè)試劑條，操作檢測(cè)只需15 min即可完成，方便攜帶，容易判定，適合屠宰場(chǎng)、產(chǎn)品驗(yàn)收?qǐng)龅痊F(xiàn)場(chǎng)初篩檢測(cè)。但是市售的檢測(cè)卡靈敏度和準(zhǔn)確度不一，大都是5 μg/L左右，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性、結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象，造成誤判[4-6]。膠體金免疫層析法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)克倫特羅的對(duì)比研究大部分為豬尿樣品的檢測(cè)[7-8]，現(xiàn)有研究報(bào)道，對(duì)膠體金標(biāo)記條件的研究較多，而對(duì)于樣品墊、吸水紙優(yōu)化的較少。因此，本研究?jī)?yōu)化克倫特羅單抗的制備方法，并對(duì)標(biāo)記的pH、抗體標(biāo)記量、離心力進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)標(biāo)記條件，對(duì)樣品墊、吸水紙、NC膜進(jìn)行探索與優(yōu)化，對(duì)比在豬肉樣品檢測(cè)中膠體金免疫層析法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)克倫特羅的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材豬肉樣品為市售。

1.1.2 試劑鹽酸克倫特羅[瘦肉精（98.8%）]、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于壇墨質(zhì)檢-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；制備膠體金免疫層析卡的原材料，例如吸水紙、NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊購(gòu)自于上海捷寧有限公司；其他試劑購(gòu)自于西安企鵝試劑有限公司。

1.1.3 儀器劃膜噴金儀購(gòu)自于上海捷寧有限公司；可編程切條機(jī)購(gòu)自于上海捷寧有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)伯樂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 克倫特羅單抗的制備以及效價(jià)檢測(cè)按照張玲玲等[9]方法采用鹽酸克倫特羅做為半抗原與載體蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶聯(lián)制備人工抗原，進(jìn)行動(dòng)物免疫和單克隆抗體的制備。

1.2.2 標(biāo)記條件確定（1）pH條件確定 將1.0 mL膠體金溶液加入1.5 mL的離心管中，調(diào)整pH依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分別加入5 μL的克倫特羅單克隆抗體，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，進(jìn)行離心，棄上清液，加入200 μL復(fù)溶液重懸，通過試紙條上T線的顯色程度確定最佳pH。

（2）抗體標(biāo)記量條件確定 將1.0 mL膠體金溶液加入1.5 mL的離心管中，將pH調(diào)節(jié)至7.5，分別加入1、3、5、10、20、40 μL的克倫特羅單克隆抗體，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，進(jìn)行離心，棄上清液，加入200 μL復(fù)溶液重懸。優(yōu)化判定原則和依據(jù)參考曹海林[10]的方法，一般取加入抗體量最少，且檢測(cè)限抑制好的抗體加入量為抗體的最小標(biāo)記量，最佳標(biāo)記量按照最小標(biāo)記量的1.2倍計(jì)算。

（3）離心力優(yōu)化 為進(jìn)一步提高金標(biāo)抗體結(jié)合力度，保證金標(biāo)抗體活性，本研究應(yīng)用不同離心力對(duì)金標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合力度優(yōu)化。具體做法為：按照3 000、5 000、8 000、12 000 r/min離心8 min，離心完后觀察上清液是否澄清及探針是否容易重懸。

1.2.3 金標(biāo)卡的制備（1）樣品墊優(yōu)化 樣品墊的選擇：選取玻璃纖維素膜GL-01、GL-02、GL-03、GL-04作為樣品墊，用相同的配方處理這4種樣品墊，進(jìn)行樣品測(cè)試。

樣品墊的處理?xiàng)l件優(yōu)化，按照表1配制6種樣品墊處理液（以PBS為基質(zhì)溶液），將樣品墊裁剪后放入處理液中，對(duì)比市場(chǎng)上常見的不同配方對(duì)樣品墊的影響情況。

表1 樣品墊處理液配方 單位：%

（2）吸水紙 吸水紙判斷的標(biāo)準(zhǔn)與樣品墊不一致。對(duì)比市場(chǎng)上常見的HS01、HS02、HS03這3種吸水紙，在吸水紙上添加30 μL中性紅溶液，在50 s內(nèi)比較溶液在吸水紙上的吸收情況，直到吸水紙完全飽和。通過測(cè)定吸水紙的吸水率來比較不同吸水紙的吸水效果，吸水率的計(jì)算公式為：吸水率=（吸水紙濕重一吸水紙干重）÷吸水紙干重×100%。

（3）NC膜 T線：將包被抗原稀釋成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根據(jù)T線陰性顯色選擇及檢測(cè)限選擇最適T線包被濃度。C線：將二抗?jié)庀♂尦?.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根據(jù)C線與T線陰性顯色選擇最適C線包被濃度。

（4）金標(biāo)墊 金標(biāo)墊采用45℃恒溫干燥和20℃~25℃自然干燥。干燥時(shí)間為15、30、45和60 min。確定最優(yōu)的干燥方式和時(shí)間。

（5）組裝 試紙條的組裝就是將NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水紙按照一定的順序粘貼PVC板上。

1.2.4 卡片應(yīng)用性檢測(cè)（1）靈敏度檢測(cè) 取克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品先用甲醇溶解，配制成10 μg/mL溶液，然后用PBS緩沖液將克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為3、5、10、15、20和40 ng/mL，以PBS緩沖液作為陰性對(duì)照。陰性：T線、C線均紅色；陽性：T線不顯色，C線紅色；待克倫特羅的濃度達(dá)到用肉眼無法觀察到檢測(cè)線（T線），而控制線（C線）比較明顯時(shí)，的濃度便為所制備的試紙條的檢出限。

（2）特異性檢測(cè) 取克倫特羅相似物萊克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特羅，分別用甲醇溶解，再用PBS緩沖液稀釋成濃度為5、10、15、20、40、100 ng/mL，用空白溶液作為陰性對(duì)照。觀察不同類似物在試紙條上的顯色情況。

（3）準(zhǔn)確度檢測(cè) 組織處理：稱?。?±0.01）g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入6 mL組織稀釋液，渦動(dòng)2 min，5 000 r/min，離心10 min。用RIDA C18柱純化，取80 μL（稀釋4倍）測(cè)定。檢測(cè)：按照試劑盒的要求，依次加入標(biāo)品和樣品、酶標(biāo)記物，經(jīng)過孵育洗滌后，加入底物，室溫避光反應(yīng)15~20 min，最后加入終止液，在450和630 nm處讀OD值。計(jì)算樣品含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 克倫特羅單抗的制備以及效價(jià)檢測(cè)

2.1.1 單克隆抗體的鑒定經(jīng)間接ELISA檢測(cè)、染色體計(jì)數(shù)、SDS-PAGE電泳和ELISA單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)可知，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 kDa，染色體數(shù)目為83~91條，親和常數(shù)為2.51×108 M?1。

2.1.2 抗體的交叉反應(yīng)率選擇與克倫特羅類似結(jié)構(gòu)或功能的藥物，替代克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50抑制濃度，計(jì)算交叉反應(yīng)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體對(duì)克倫特羅的交叉反應(yīng)為100%，對(duì)沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為12%，對(duì)特布他林的交叉反應(yīng)率為8%，對(duì)西馬特羅、維多洛爾和萊克多巴胺的交叉反應(yīng)為0.2%，對(duì)普萘洛爾、阿替洛爾、間羥胺、拉貝洛爾、氧烯洛爾、異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應(yīng)均<0.1%。

選擇與克倫特羅類似結(jié)構(gòu)或功能的藥物，替代克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50抑制濃度，計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表2。

表2 抗體交叉反應(yīng)率 單位：%

2.2 標(biāo)記條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 pH條件確定結(jié)果顯示：根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，膠體金蛋白質(zhì)的吸附力最強(qiáng)；pH過高過低都不利于兩者的結(jié)合，圖1顯色當(dāng)pH為8時(shí)，T線顯色最深，所以最適pH為8。

圖1 pH條件優(yōu)化圖

2.2.2 抗體標(biāo)記量條件確定抗體標(biāo)記量條件優(yōu)化結(jié)果如表3所示。

膠體金標(biāo)記的2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)的pH和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。膠體金與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是否合適是影響標(biāo)記成功的一個(gè)重要因素。過多蛋白質(zhì)標(biāo)記，在造成浪費(fèi)的同時(shí)，又會(huì)引起試紙的拖帶現(xiàn)象；過少蛋白質(zhì)標(biāo)記又會(huì)導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全，從而降低試紙的靈敏度及假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)。隨著抗體標(biāo)記量的增加，陰性顯色也會(huì)增加，但是當(dāng)抗體標(biāo)記量大于10 μL/mL時(shí)，陰性顯色會(huì)變淺，并且檢測(cè)限抑制也會(huì)變差。當(dāng)抗體標(biāo)記量在10 μL/mL時(shí)，陰性T線顯色及檢測(cè)限顯色梯度最大，所以最佳抗體標(biāo)記量為10 μL/mL的120%，即為12 μL/mL（表3）。

表3 抗體標(biāo)記量條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.3 離心力優(yōu)化當(dāng)離心力為3 000、5 000 r/min時(shí)，上清液渾濁，說明離心力不夠，還有一部分膠體金沒有離心下來。當(dāng)離心力為8 000、12 000 r/min時(shí)，上清液澄清，但是離心力為12 000 r/min時(shí)，探針不容易重懸，說明最佳離心力為8 000 r/min。

2.3 金標(biāo)卡制備優(yōu)化

2.3.1 樣品墊優(yōu)化樣品墊優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果表明，4種規(guī)格的樣品墊中，3號(hào)樣品墊顯色最深，而且線條均一，故選擇GL-03型樣品墊。

圖2 樣品墊優(yōu)化結(jié)果

圖3左圖顯示的是相同的時(shí)間里陰性樣本對(duì)照?？煽闯?，配方1、2顯色比較好，配方3、4、5次之，配方6出現(xiàn)中空現(xiàn)象；但是從右圖的陽性對(duì)照看，配方1、2、3、4不能完全消線，而配方5可以完全消線。因此，選擇配方5，優(yōu)化確定樣品墊的處理配方為0.01 mol/L pBS+1%BSA+1%吐溫?20。

圖3 樣品墊處理配方的結(jié)果

2.3.2 吸水紙3種樣品墊對(duì)中性紅溶液的吸收情況表明，HS01、HS02、HS03吸水率分別為159.2、123.4、129.5，這也說明HS01吸水紙的吸水量最大，故選擇HS01吸水紙。

2.3.3NC膜（1）T線濃度確定 T線濃度顯色結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，隨著包被抗原濃度的增加，檢測(cè)線（T線）的顯色越來越明顯，當(dāng)抗原包被濃度為1.0 mg/mL時(shí)，T線陰性顯色及檢測(cè)限顯色差異最大，所以T線最適包被濃度為1.0 mg/mL。

表4 T線濃度確定結(jié)果

（2）C線濃度確定 C線濃度確定結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，隨著二抗包被濃度的增加，質(zhì)控線（C線）的顯色越來越明顯，當(dāng)二抗包被濃度為0.5 mg/mL時(shí)C/T線顯色基本一致，所以C線最適包被濃度為0.5 mg/mL。

表5 C線濃度確定結(jié)果

2.3.4 金標(biāo)墊干燥方式優(yōu)化不同干燥方式對(duì)試紙條顯色效果的影響如表6所示。從表6可以看出，干燥30 min顯色效果劣于干燥45和60 min，室溫干燥優(yōu)于加熱干燥，可能在加熱時(shí)，金標(biāo)抗體在泳動(dòng)時(shí)集中在NC膜的兩邊，導(dǎo)致顯色效果不佳。故室溫干燥45 min為最佳條件。

表6 不同干燥方式對(duì)試紙條顯色效果的影響

2.4 卡片應(yīng)用性檢測(cè)

2.4.1 靈敏度檢測(cè)靈敏度檢測(cè)結(jié)果（表7）表明，克倫特羅檢測(cè)卡在1 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)T線顯色略微有影，3 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)T線不顯色，說明克倫特羅檢測(cè)卡的靈敏度為3 ng/mL。

表7 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 特異性檢測(cè)特異性檢測(cè)結(jié)果（表8）表明，添加不同濃度的萊克多巴胺、沙丁胺醇、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)克倫特羅檢測(cè)卡均未發(fā)生抑制作用，說明克倫特羅檢測(cè)卡特異性比較好。

表8 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.4.3 準(zhǔn)確度檢測(cè)

共檢測(cè)了150個(gè)豬組織樣品，比較上述2種方法的檢測(cè)結(jié)果。ELISA陽性豬組織樣品16份，陽性率10.67%；膠體金法豬組織樣品14份，陽性率9.33%，2種檢測(cè)方法陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。本研究研制的克倫特羅檢測(cè)卡與酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定值符合率較高。

3 結(jié)論

鹽酸克倫特羅被國(guó)家明令禁止使用。本文優(yōu)化克倫特羅單抗的制備方法，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 kDa，染色體數(shù)目為83~91條，親和常數(shù)為2.51×108 M?1，得到最佳的標(biāo)記條件pH=8、最佳抗體標(biāo)記量為10 μL/mL的120%（12 μL/mL）、最佳離心力為8 000 r/min。與傳統(tǒng)的卡片相比，本研究對(duì)樣品墊、吸水紙、金標(biāo)墊干燥方式進(jìn)行探索與優(yōu)化，優(yōu)化確定樣品墊的處理配方為0.01 mol/L pBS+1% BSA+1%吐溫-20，選擇HS01吸水紙作為吸水紙，金標(biāo)墊干燥方式為室溫干燥45 min。得到的膠體金卡準(zhǔn)確度、靈敏度、保質(zhì)期更優(yōu)。經(jīng)試驗(yàn)，本研究克倫特羅檢測(cè)卡檢出限為3 ng/mL，優(yōu)于市面上的檢測(cè)卡片，與萊克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特羅無交叉反應(yīng)，特異性好，與酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定結(jié)果符合率良好，準(zhǔn)確度高，適宜在屠宰場(chǎng)、產(chǎn)品驗(yàn)收?qǐng)龅痊F(xiàn)場(chǎng)的初篩檢測(cè)活動(dòng)。