固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素含量及其分布狀況

蔡 琛，程先先，吳學(xué)森

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,安徽蚌埠 233000；2蚌埠市疾病預(yù)防控制中心，安徽蚌埠 233000)

交鏈孢霉在自然界中分布范圍極其廣泛，對一些植物不僅具有腐生性，還具有致病性[1]。低溫條件下交鏈孢霉菌能夠正常生長繁殖，因此在冷鏈儲藏和運輸過程中食品也會存在腐敗和變質(zhì)[2]。該菌能產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物，對人畜具有致癌作用并影響人畜健康。有研究表明，攝入被交鏈孢毒素污染的食品可能造成我國某些地區(qū)食管癌高發(fā)[3]。因此，食品中交鏈孢毒素的污染情況已成為重要的危害人體健康的公共衛(wèi)生問題。橄欖油含有較高水平的單不飽和脂肪酸，研究表明，食用單不飽和脂肪酸有降低血糖[4]、調(diào)節(jié)血脂[5]、降低膽固醇[6]等功效，越來越多居民選擇橄欖油。2019—2020年，我國已成為橄欖油進(jìn)口量增長的第二大市場，我國將成為未來世界第一大橄欖油消費國[7]。本研究就固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素含量及其分布狀況進(jìn)行分析。

1 食品污染中最常見的交鏈孢毒素

污染食品的交鏈孢霉種類多種多樣，其產(chǎn)生的交鏈孢毒素主要包括交鏈孢菌酮酸(TeA) 、交鏈孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、交鏈孢酚單甲醚(AME) 4類毒素[8]。

2 交鏈孢毒素的毒性

大多數(shù)交鏈孢毒素對人體造成的急性毒性程度較低。但有研究表明，AOH、AME對細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性[9]和導(dǎo)致細(xì)胞突變[10]。FehR等[11]研究認(rèn)為，AOH和AME在微摩爾濃度下顯著增加了人類癌細(xì)胞(HT29,A431)的DNA鏈斷裂率，其中AOH有效地抑制了DNA的松弛，并刺激了拓?fù)洚悩?gòu)酶I、IIα和IIβ的DNA裂解活性從而引起細(xì)胞 DNA損傷。YEKELER等[12]研究認(rèn)為，AME和TeA對小鼠食道可能產(chǎn)生毒性影響。實驗表明，每天給小鼠喂食AME或TeA，持續(xù)10個月后，通過光鏡檢查，在TeA處理的動物中觀察到中度和嚴(yán)重的發(fā)育不良，其特征是極性喪失、核多形性和超色性，表現(xiàn)為食管粘膜出現(xiàn)癌前病變。Lehmann等[13]用AOH 處理V79細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂周期停滯在G2和S期。Wollenhaupt等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AOH對豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生存能力有影響。在用 AOH處理后，S期的細(xì)胞明顯減少，而G(0)/G(1)期的細(xì)胞停滯，因此認(rèn)為AOH在翻譯水平上影響基因的表達(dá)。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)，AME和AOH可與從人胎兒食道上皮細(xì)胞中分離出的DNA結(jié)合，激活其中的致癌物質(zhì)c-H-ras和c-mys，并在體外促進(jìn)人胎兒食道上皮細(xì)胞的增殖，其次在食道癌高發(fā)區(qū)林縣的糧食中分離出來的主要污染性真菌為AOH和AME，因此認(rèn)為進(jìn)食被交鏈孢毒素污染的食品可能與中國某些地區(qū)食管癌高發(fā)有關(guān)。

3 材料與方法

3.1 材料與試劑

3.1.1 材料 包裝橄欖油，市場購買。

3.1.2 試劑 細(xì)交鏈格孢菌酮酸(TeA，純度>99%)、鏈格孢酚(AOH，純度>99%)、騰毒素(TEN，純度>99%)和交鏈格孢酚單甲醚(AME，純度>99%)標(biāo)準(zhǔn)品，均購于美國 ROMER 公司；同位素內(nèi)標(biāo)：細(xì)交鏈格孢菌酮酸-D13(TeA-D13，純度>99%)、鏈格孢酚-D2(AOH-D2，純度>99%)、騰毒素-D3(TEN-D3，純度>99%)、交鏈格孢酚單甲醚-D3(AME-D3，純度>99%)、標(biāo)準(zhǔn)品，均購于加拿大 TRC 公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購于美國Thermor Fisher公司；無水磷酸二氫鈉(色譜純)，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫銨(色譜純)，上海羅恩化學(xué)試劑有限公司；磷酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)：稱取6.0 g無水磷酸二氫鈉，溶解于950 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0，用水定容至1 000 mL，混勻；固相萃取柱(Waters Oasis HLB 200 mg/6cc)；樣品提取液：取550 mL乙腈，加到450 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)中，混勻；水(符合GB/T 6682規(guī)定的一級水)。

3.2 儀器與設(shè)備

Thermo Fisher 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國ThermoFisher公司，配有Hypersil Gold VANQUISH C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；超聲波清洗器，上?？破鲀x器設(shè)備有限公司；多管渦旋混勻儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；離心機(jī)，美國ThermoFisher公司；1/千電子天平，瑞士Mettle公司；50 mL塑料離心管，浙江拱東醫(yī)療器械股份有限公司；Milli-QA10 超純水器，美國 Millipore公司；固相萃取儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；氮吹儀，上海喬躍電子有限公司；移液器(1～10、10～100、100～1 000 μL)，德國eppendorf公司。

3.3 方法

3.3.1 超高效液相色譜條件 色譜柱型號：Hypersil Gold VANQUISH C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫條件：40℃；流動相配比：A(1.0 mmol/L碳酸氫銨溶液)+B(甲醇)，采用梯度洗脫；梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.25 mL/min。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序

3.3.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 離子化模式：采用電噴霧離子源(ESI)；電離方式：負(fù)離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3 500V；離子源溫度：350℃；鞘氣流量：35 Arb；碰撞氣流量：10 Arb；反吹氣流量：1 Arb。4種鏈格孢霉毒素及同位素內(nèi)標(biāo)物的保留時間、監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 4種交鏈孢霉菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 (1)同位素內(nèi)標(biāo)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取4種交鏈孢霉毒素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，混勻，得到TeA-D13儲備液(100 μg/mL)、AOH-D2儲備液(100 μg/mL)、TEN-D3儲備液(100 μg/mL)、AME-D3儲備液(100 μg/mL)，密封后置于-20℃避光保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取適量4種鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，混勻，得到TeA標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)、AOH標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100μg/mL)、TEN標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)、AME標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)，密封后置于-20℃避光保存。(3)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(TeA：500 ng/mL，AOH：200 ng/mL，TEN：100 ng/mL，AME：20 ng/mL)：分別準(zhǔn)確移取50 μLTeA標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，密封后置于4℃避光保存。(4)混合內(nèi)標(biāo)工作液(TeA-D13：500 ng/mL，AOH-D2：200 ng/mL，TEN：100 ng/mL，AME：20 ng/mL)：分別準(zhǔn)確移取50 μLTeA-D13標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH-D2儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN-D3儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME-D3儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，密封后置于-20℃避光保存。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)工作液，用甲醇和水配置成標(biāo)準(zhǔn)系列，具體配置信息見下表3。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到4種交鏈孢霉菌毒素的色譜圖和峰面積。分別以TeA、AOH、TEN、AME的濃度為橫坐標(biāo)，以TeA、AOH、TEN、AME的峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制TeA、AOH、TEN、AME標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

表3 4種交鏈孢霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)系列的配置方法

3.3.4 樣品前處理方法 (1)提?。洪蠙煊椭糜诔乇芄獗４?，稱樣前需充分混勻。然后稱取橄欖油5 g(精確至0.001 g)于50 mL刻度離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻10 s，靜置過夜。樣品中加入25 mL樣品提取液，旋緊蓋子，渦旋混勻10 s，高速渦旋振蕩器震蕩提取20 min，于4℃，10 000 r/min離心10 min，室溫靜置2 h，待溶液明顯分層且上清液無細(xì)小油粒后，移取5 mL上清液，加入15 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)，混勻，10 000 r/min離心10 min，上清液待凈化。(2)凈化：HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化。將稀釋后的上清液(20 mL)全部過柱，再用5 mL 20%甲醇溶液淋洗，于負(fù)壓狀態(tài)下抽干柱子5 min。將小試管放于固相萃取柱下，依次用5 mL甲醇和5 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于小試管中，45℃水浴氮吹近干，殘渣先用200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻10 s，再加1.8 mL水，渦旋混勻10 s。4℃，10 000 r/min下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液經(jīng)LC-MS/MS進(jìn)行檢測。

4 結(jié)果與分析

4.1 線性關(guān)系和檢出限

在優(yōu)化的高效液相色譜、質(zhì)譜和前處理條件下對空白基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行檢測。表4結(jié)果表明，4種交鏈孢霉毒素在一定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，R>0.99。在信噪比為3 時，TeA 、AOH 、TEN、AME的檢出限在0.20～2.00 μg/kg 范圍之間。

表4 4種交鏈孢霉菌毒素的線性范圍、線性方程、R、檢出限

4.2 加標(biāo)回收率

30份樣本中隨機(jī)選擇3份樣本，分別取其平行樣，在每份樣本平行樣中分別加入50 ngTeA、20 ngAOH、10 ngTEN、2 ngAME，與該樣本進(jìn)行相同處理后經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，計算得出回收率范圍92.25%～124.66%，精密度范圍3.79%～10.58%(表5)。

表5 4種交鏈孢霉菌毒素的加標(biāo)回收率

4.3 橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素污染水平含量分析

本次橄欖油樣本量30份，每份樣本平行檢測6次取平均值。4種交鏈孢霉菌毒素在30份橄欖油中有不同濃度水平的檢出，總檢出率93.33%，總含量范圍0.631～4.261 μg/kg。AME檢出率最高93.33%，含量范圍0.631～9.098，最大濃度9.722 μg/kg，平均濃度2.361 μg/kg；AOH檢出率20.00%，含量范圍2.760～4.261，最大濃度4.261 μg/kg，平均濃度3.351 μg/kg；TEN檢出率10.00%，含量范圍0.705～1.288，最大濃度1.288 μg/kg，平均濃度0.959 μg/kg；TeA在30份樣本中未檢出，檢出率0.00%(表6)。

表6 4種交鏈孢霉菌毒素檢出率、含量范圍、最大濃度、平均濃度

4.4 橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素疊加檢出分析

30份橄欖油樣本中1種交鏈孢霉菌毒素檢出率93.33%，其中AOH檢出率20.00%、TEN檢出率10.00%、AME檢出率93.33%；2種交鏈孢霉菌毒素同時檢出率30.00%，其中TEN+AME同時檢出率10.00%、AOH+AME同時檢出率20.00%；3種交鏈孢霉菌毒素AOH+TEN+AME同時檢出率3.33%(表7)。

表7 交鏈孢霉菌毒素疊加檢出個數(shù)、檢出率

4.5 國產(chǎn)和進(jìn)口橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素檢出分析

5份國產(chǎn)橄欖油中均檢測出交鏈孢霉菌毒素，檢出率100.00%。25份進(jìn)口橄欖油中檢測出23份含有交鏈孢霉菌毒素，檢出率92.00%(表8)。但在5份國產(chǎn)橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME，其他3種交鏈孢霉菌毒素均未檢出。25份進(jìn)口橄欖油中AOH檢出6份，檢出率24.00%；TEN檢出3份，檢出率12.00%；AME檢出23份，檢出率92.00%(表9)。

表8 不同產(chǎn)地交鏈孢霉菌毒素檢出率

表9 不同產(chǎn)地4種交鏈孢霉菌毒素檢出率

5 結(jié)論與討論

建立固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素的分析方法。本方法樣本檢測量小、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高，重現(xiàn)性好，是檢測橄欖油中交鏈孢霉毒素的理想方法。對采集的30份橄欖油進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93.33%(28/30)的樣品至少受到1種交鏈孢霉毒素污染。橄欖油中4種交鏈孢霉毒素檢出率AME>AOH>TEN>TeA，AME毒素是橄欖油中最主要的檢出毒素。在交鏈孢霉菌毒素疊加檢出率分析中發(fā)現(xiàn)30.00%(9/30)的樣品受到2種及2種以上交鏈孢霉菌毒素污染。國產(chǎn)和進(jìn)口橄欖油中分析發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME，進(jìn)口橄欖油檢出成分有AOH、TEN、AME。

本研究僅測定包裝橄欖油中4種交鏈孢霉毒素，有文獻(xiàn)顯示[16]，糧油作物在入庫儲存前若水分未降至安全水分界限(≤14%) 則易發(fā)生霉變產(chǎn)生交鏈孢霉毒素。橄欖油中交鏈孢霉毒素的檢出，不確定是橄欖中本身含有還是儲存過程中產(chǎn)生，又或者壓榨工藝中存在污染，還需要進(jìn)一步探討。目前交鏈孢霉毒素種類繁多，在食物中污染范圍較廣，尤其是存在于小麥、玉米等農(nóng)作物及其制品中[17-18]，其對人體健康的危害性尚沒有引起廣泛的關(guān)注。Lattanzio等[19]對97份意大利谷物、番茄和葵花籽樣本中均檢出TeA、AOH、TENA、ME，其中，TeA污染水平最高為16 752 μg/kg，TEN污染水平最高為570 μg/kg。李磊等[20]研究發(fā)現(xiàn)，20份菜籽油中，2份樣品檢出TeA，3份樣品檢出AOH，本次研究填補(bǔ)了固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中交鏈孢霉毒素的空白。由于我國目前尚未對食品中交鏈孢霉毒素的檢出方法、限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)定，本次研究為將來交鏈孢霉毒素的風(fēng)險評估和標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支持，從而更好地保護(hù)消費者健康。