超高效液相色譜法定量檢測(cè)干果中20種酸性染料

楊濤，劉俊，劉衛(wèi)國*，粟有志，常要寶，毛雨晴

1(新疆大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830017)2(綠洲生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830017)3(成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都，610041)4(伊寧海關(guān)技術(shù)中心，新疆 伊寧，835099)

色彩鮮艷的食品往往能在外觀上吸引消費(fèi)者和提高消費(fèi)者對(duì)食品的信賴感[1]。因此，不法商販將價(jià)格更低廉的合成染料添加到食品和藥品中以增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力。其中，酸性染料因其價(jià)格便宜、色牢度強(qiáng)，也被使用在食品中。酸性染料一般為含磺酸基偶氮染料，在酸性條件下可對(duì)蛋白質(zhì)纖維染色。據(jù)報(bào)道，合成染料在食品中過度使用會(huì)引起人體的興奮和過敏反應(yīng)[2-3]。為了加強(qiáng)食品安全，許多國家頒布了不同的規(guī)章制度來限制合成染料在食品中可以使用的種類和劑量，如歐洲委員會(huì)頒布的關(guān)于食品接觸塑料著色劑使用的決議AP(89)1以及中國政府頒布的GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》。在規(guī)定中，食品均禁止使用酸性染料。不法商家在食品中使用酸性染料將嚴(yán)重威脅人類的健康安全。

我國針對(duì)食品添加劑的測(cè)定出臺(tái)了GB/T 5009.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》對(duì)部分染料檢測(cè)的方法，也有很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)中合成染料的分析方法有伏安法[4]、光譜法[5]、薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)[6]、極譜法[7]、毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)[8]、HPLC法。其中最常用的方法是HPLC。FENG等[9]改良了一種HPLC-MS/MS，該方法可以同時(shí)檢測(cè)40種合成染料。BONNAN等[10]優(yōu)化的高效液相色譜法串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-diode array detector，HPLC-DAD)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，該方法能同時(shí)檢測(cè)飲料中的17種合成染料。據(jù)報(bào)道[11-12]，HPLC-MS/MS系統(tǒng)具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但是由于價(jià)格高昂、操作復(fù)雜。HPLC-DAD系統(tǒng)則可以兼顧靈敏度和成本之間的沖突，而在處理基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品時(shí)，往往表現(xiàn)出色譜分離性較差的現(xiàn)象。

隨著HPLC技術(shù)的發(fā)展，食品中染料檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在了水、飲料以及辣椒制品等產(chǎn)品中[13-15]，但對(duì)于干果這類機(jī)制較為復(fù)雜的食品報(bào)道較少。部分食品中的凝膠、脂質(zhì)會(huì)干擾色譜柱，因此在測(cè)定含有復(fù)雜基質(zhì)的食品時(shí)，HPLC方法的靈敏度很差[16]。含有高油脂、高凝膠的干果等食品通過適當(dāng)?shù)那疤幚沓绦驕p少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，是一個(gè)研究的方向。目前，常見的食品前處理方法有膜過濾法[17-18]、固相萃取法[10,19]、凝膠色譜柱凈化法(gel permeation chromatography，GPC)[20]、液相萃取法[21-22]等。在萃取時(shí)也通常采用超聲波及微波來輔助提取[23]。

在本研究中，對(duì)提取試劑進(jìn)行了優(yōu)化，并采用GPC對(duì)提取液進(jìn)一步凈化，通過對(duì)20種目的酸性染料光譜特性的分析，確定最佳檢測(cè)波長。在實(shí)際樣品檢測(cè)中被證實(shí)，一種依托于UPLC-DAD的分析方法被提出，它可以高效、快速地測(cè)定干果中的20種酸性染料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞、葡萄干均采購于新疆烏魯木齊當(dāng)?shù)剞r(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)；20種酸性染料標(biāo)準(zhǔn)品：酸性黃23、酸性紅18、酸性紫7、酸性橙10、酸性紅35、酸性紅14、酸性綠5、酸性紅73、酸性黑1、酸性橙7、酸性黑24、酸性橙56、酸性紫43、酸性紫17、酸性藍(lán)62、酸性藍(lán)7、酸性黃151、酸性黃79、酸性棕282、酸性綠73(純度>98%)，德國Dr Ehrenstorfer公司。分別稱取20種酸性染料標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水稀釋至1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用前再逐級(jí)稀釋；乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher公司；乙酸(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；乙酸銨、乙酸乙酯(色譜純)，德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜配備二極管陣列檢測(cè)器，美國Waters公司；AL204-IC電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-600B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；隔膜真空泵，天津奧特塞恩斯儀器有限公司；氮吹儀，美國Organomation公司；AccuPrep MPS凝膠凈化儀，美國J2 Scientific 公司；0.22 μm有機(jī)相濾膜；試驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q公司超純水器純化的超純水。

1.3 樣品前處理

將葡萄干、枸杞等樣品凍干后研磨成粉末狀態(tài)，并稱取等量的葡萄干、枸杞粉末混勻備用。

準(zhǔn)確稱取5.0 g破碎后的均勻試樣，置于50 mL離心管中，加入20 mL提取液(17 mL乙腈、3 mL超純水)。超聲提取20 min后，以8 000 r/min離心5 min。收集上清液，用氮?dú)獯抵两?。再將殘?jiān)芙庥?0 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(體積比1∶1)中，采用GPC凈化。

GPC凈化條件：聚苯乙烯凝膠(Biobeads S-X3填料，100 g，400 mm×25 mm)；以乙酸乙酯-環(huán)己烷(體積比1∶1)為淋洗劑；流速為5.0 mL/min；進(jìn)樣體積為5.0 mL；收集22～30 min的洗脫液。將洗脫液于40 ℃下用氮?dú)獯抵两?。再將殘?jiān)?.0 mL乙腈-水(體積比1∶1)溶解，過0.22 μm有機(jī)相膜待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱采用ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相：A為20 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，掃描范圍為210～750 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。UPLC梯度洗脫程序?yàn)?～8 min，90% A；8～11 min，70% A；11～20 min，63% A；20～30 min，55% A；30～37 min，30% A；37～40 min，0% A；40～44 min，0% A；44～47 min，90% A；47～49 min，90% A。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理過程優(yōu)化

干果之中基質(zhì)復(fù)雜，通常包含大量的脂質(zhì)、凝膠及碳水化合物，這些物質(zhì)會(huì)影響色譜柱的正常分離從而阻礙色譜的正常分離[13]，因此，需對(duì)前處理過程進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化以減輕基質(zhì)效應(yīng)。

酸性染料一般含有磺酸基，易溶于水。本實(shí)驗(yàn)選取水以及與水極性相近的甲醇和乙腈3種提取溶劑。研究表明，當(dāng)使用甲醇為提取劑時(shí)，樣品經(jīng)溶解后為漿糊狀，高速離心后仍分層不明顯，從而無法準(zhǔn)確測(cè)定；當(dāng)使用乙腈、水為提取溶劑時(shí)，所有染料均可檢出，但酸性橙10、酸性紅73等染料回收率小于32%，未達(dá)到檢測(cè)要求?？紤]到乙腈和水的萃取特性，通過不斷增加乙腈-水溶液中水的比例，來探求一種合理的萃取溶劑。當(dāng)乙腈和水的體積比為19∶1、18∶2時(shí)，酸性橙10的回收率均低于50%；當(dāng)乙腈和水的體積比為17∶3時(shí)，除酸性藍(lán)7和酸性黃151的回收率為72%左右，其余染料回收率均高于82%，萃取效果良好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取乙腈-水(體積比17∶3)為提取溶劑。

采用GPC凈化方法將干果中的脂質(zhì)、多糖等干擾雜質(zhì)去除。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在22 min前收集液無染料檢出，在22～30 min中收集液中開始檢出染料，30 min后收集液無染料檢出。因此，收集時(shí)間為22～30 min。脂質(zhì)、糖類等干擾分子在10 min前被檢出，說明該凈化方法有效的避免了基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 檢測(cè)波長確定

研究表明，在確定最佳洗脫條件后，將檢測(cè)波長設(shè)定為260、312、300、400、427、500、540、634 nm時(shí)，酸性橙10、酸性紅14、酸性黑24、酸性紫43、酸性紫7、酸性藍(lán)62，均能達(dá)成有效分離，但其他14種并未實(shí)現(xiàn)有效分離。為進(jìn)一步提高方法的定性分析能力，本實(shí)驗(yàn)利用DAD對(duì)其余14種酸性染料進(jìn)行光譜信息采集，得到其完整的光譜圖，如圖1所示。在210～750 nm波長范圍內(nèi)，均有可檢測(cè)定性的峰出現(xiàn)。該方法確定了16種酸性染料的最佳吸收波長。實(shí)驗(yàn)證明，該方法有效的提高了20種酸性染料檢測(cè)的靈敏度和特異性，減少了共存物質(zhì)的干擾，使各物質(zhì)均達(dá)到有效分離。利用DAD中特定程序，根據(jù)20種酸性染料的出峰順序，以最佳吸收波長進(jìn)行檢測(cè)，所得液相色譜圖如圖2所示。

圖1 14種酸性染料的光譜圖

1-酸性黃23;2-酸性紅18;3-酸性紫7;4-酸性橙10;5-酸性紅35;6-酸性紅14;7-酸性綠5;8-酸性紅73;9-酸性黑1;10-酸性橙7;11-酸性黑24;12-酸性橙56;13-酸性紫43;14-酸性紫17;15-酸性藍(lán)62;16-酸性藍(lán)7;17-酸性黃151;18-酸性黃79;19-酸性棕282;20-酸性綠73

2.3 方法靈敏度(線性范圍、檢出限、定量限)

配制20種酸性染料系列標(biāo)準(zhǔn)混合液(5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL)進(jìn)行測(cè)定。以20種染料的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合，線性結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示除酸性黑24和酸性橙56外，其余18種酸性染料在5～50 μg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.98。酸性黑24和酸性橙56則在10～80 μg/mL和10～60 μg/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9 和0.988 3。儀器的檢測(cè)限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)分別為3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)的濃度(表1)，該方法的LOD和LOQ分別為0.01～0.08 μg/g和0.04～0.25 μg/g。

表1 二十種染料的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.4 方法精密度與準(zhǔn)確度

對(duì)干果(枸杞和葡萄干)樣品采用外標(biāo)法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為5、10、20 μg/mL，依照優(yōu)化后的方法平行測(cè)定6份。分析結(jié)果列于表2，空白加標(biāo)樣本的液相色譜圖如圖3所示。結(jié)果表明，該方法可避免雜質(zhì)干擾。在添加量為5～20 μg/mL時(shí)，干果中20種酸性染料的回收率在71%～114%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)小于7.5%。因此，本方法對(duì)測(cè)定干果中的20種酸性染料具有良好的準(zhǔn)確性、精密度。

表2 干果中20種染料的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

1-酸性黃23;2-酸性紅18;3-酸性紫7;4-酸性橙10;5-酸性紅35;6-酸性紅14;7-酸性綠5;8-酸性紅73;9-酸性黑1;10-酸性橙7;11-酸性黑24;12-酸性橙56;13-酸性紫43;14-酸性紫17;15-酸性藍(lán)62;16-酸性藍(lán)7;17-酸性黃151;18-酸性黃79;19-酸性棕282;20-酸性綠73

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

為了確認(rèn)優(yōu)化方法的可行性，于新疆烏魯木齊市農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)葡萄干、枸杞等各65批次樣品，并使用本文優(yōu)化的方法對(duì)20種酸性染料進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，其中3個(gè)批次的枸杞和葡萄干中均檢測(cè)到酸性紅18，最高濃度為1.91 μg/g。其余19種酸性染料均未檢出。實(shí)驗(yàn)證明，在干果中確有酸性染料存在，但均低于《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的使用量。

3 結(jié)論

本文建立了一種依托于超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定干果中的20種酸性染料的方法，該方法使用乙腈-水溶劑提取、使用GPC凈化的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并分析了20種酸性染料的光譜特性，優(yōu)化了檢測(cè)條件。經(jīng)檢驗(yàn)，該方法線性范圍良好，檢測(cè)限和定量限較低，具有良好的回收率和準(zhǔn)確性。本方法成本低、檢測(cè)快，適合批量檢測(cè)干果中的酸性染料的含量。